動物(wù)組蛋白(bái)提取試劑盒
(Animal
Total Histone Extraction Kit)
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産品貨号
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名稱
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規格
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RTD8110
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動物(wù)組蛋白(bái)提取試劑盒
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50次
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● 産品簡介
組蛋白(bái)（Histone）是指所有真核生(shēng)物(wù)的細胞核中，與DNA結合存在的堿性蛋白(bái)質的總稱，它和DNA共同組成核小(xiǎo)體結構。它們是染色質的主要蛋白(bái)質組分，作為(wèi)DNA纏繞的線軸，并在基因調控中發揮作用。組蛋白(bái)通(tōng)常含有H1，H2A，H2B，H3，H4等5種成分。除H1外，其他4種組蛋白(bái)均分别以二聚體(共八聚體）相(xiàng)結合，形成核小(xiǎo)體核心。DNA便纏繞在核小(xiǎo)體的核心上(shàng)。而H1則與核小(xiǎo)體間的DNA結合。因此，一(yī)般認為(wèi)組蛋白(bái)作為(wèi)結構支持體的作用比其基因調節作用更為(wèi)重要。組蛋白(bái)可受到(dào)甲基化、乙酰化、磷酸化、聚ADP核糖酰化，以及與泛醌(ubiquinone）相(xiàng)結合等幾種類型的修飾。組蛋白(bái)的修飾與染色質結構的變化及基因活性的控制關系緊密。
該試劑盒采用優化配方，可以迅速從(cóng)細胞或組織中提取組蛋白(bái)，同時配套有HDAC(Histone
deacetylase，組蛋白(bái)去乙酰化酶)抑制劑，可以維持組蛋白(bái)酰基化水(shuǐ)平。
對于細胞樣品，如果每個(gè)樣品的數量不超過一(yī)千萬個(gè)（107）細胞（細胞沉澱體積PCV
100 μl），本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品；對于組織樣品，如果每個(gè)樣品的重量不超過50
mg，本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品。每一(yī)千萬細胞或100
mg組織提取的組蛋白(bái)含量約為(wèi)0.4 mg。
● 産品組成
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産品編号
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名稱
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規格
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貯存
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RTD8110-01
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裂解緩沖液
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100 ml
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4℃
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RTD8110-02
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提取緩沖液
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15 ml
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4℃
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RTD8110-03
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中和緩沖液
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5 ml
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4℃
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RTD8110-04
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去乙酰化酶抑制劑（40×）
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5 ml
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-20℃
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RTD8110-05
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1 M DTT（500×）
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0.1 ml
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-20℃
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RTD8110-06
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PMSF（100×）
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1.5 ml
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-20℃
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● 貯存條件(jiàn)和運輸：
按照(zhào)标簽溫度貯存，一(yī)年(nián)有效；試劑盒濕冰運輸。
● 使用方法：
一(yī) 培養細胞組蛋白(bái)提取：
1.1 即用型裂解緩沖液配制：
常溫融解試劑盒中的試劑，溶解後立即放(fàng)置在冰上(shàng)，混勻。取适當體積的裂解緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的PMSF（100×）和1/50體積去乙酰化酶抑制劑（40×），配成
即用型裂解緩沖液，随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。
1.2 準備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：用PBS漂洗一(yī)遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下(xià)細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器(qì)吹打下(xià)細胞。450
g 4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需要抽提的目的蛋白(bái)。
1.2.2
對于懸浮細胞：450
g 4℃離心5
min收集細胞，用PBS洗一(yī)遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。
1.3 按照(zhào)下(xià)表加入各種試劑體積：
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細胞數量
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細胞沉澱體積（PCV）（μl）
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即用型裂解緩沖液（μl）
第一(yī)次裂解
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即用型裂解緩沖液（μl）
第二次裂解
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1×107
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100
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1000
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500
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注：1×107(一(yī)千萬)HeLa細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）約為(wèi)100 μl。
1.4 細胞裂解：
1.4.1第一(yī)次裂解：細胞沉澱中加入即用型裂解緩沖液（10倍PCV體積），用移液器(qì)吹打重懸細胞沉澱，不要渦旋震蕩，把細胞沉澱完全懸浮并分散開(kāi),冰浴15分鍾，間歇混勻。
1.4.2
第二次裂解：600
g 4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，細胞沉澱中加入即用型裂解緩沖液（5倍PCV體積）。
1.4.3
勻漿：用超聲破碎細胞（推薦130W功率超聲1分鍾，超聲2秒(miǎo)，停頓3秒(miǎo)）或用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次或使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719，蛋白(bái)提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物(wù)，冰浴處理15分鍾。
注：此步驟不要過度勻漿或超聲處理，否則得到(dào)的組蛋白(bái)會(huì)污染較多(duō)的胞漿蛋白(bái)，可以用台盼藍染色觀察細胞裂解情況，建議70-80%細胞裂解為(wèi)适宜裂解程度。加入裂解緩沖液後，細胞膜完全破裂，胞漿完全釋放(fàng)，但細胞核保持完整。鏡檢下(xià)可以看(kàn)到(dào)完全染成藍色的細胞核。
1.4.4 4℃16,000g離心15分鍾，去掉上(shàng)清，保留沉澱。
1.5 細胞組蛋白(bái)提取：
1.5.1 沉澱重懸于0.25 ml 提取緩沖液中，超聲處理（推薦130W功率超聲2分鍾，超聲2秒(miǎo)，停頓3秒(miǎo)），冰浴30分鍾，間歇混勻。
注：超聲處理為(wèi)必須步驟，否則沉澱很難徹底溶解，大大降低(dī)組蛋白(bái)提取得率。
1.5.2 4℃ 16000g 離心10分鍾，收集組蛋白(bái)上(shàng)清。
1.5.3 即用型中和緩沖液配制：
取适當體積的中和緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的PMSF（100×），1/40體積去乙酰化酶抑制劑和1/500體積
1M DTT，配成即用型中和緩沖液，随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。
1.5.4 組蛋白(bái)上(shàng)清中加入0.3倍體積即用型中和緩沖液，混勻，即為(wèi)組蛋白(bái)提取溶液。
注：組蛋白(bái)溶液電(diàn)泳檢測時，如果加入上(shàng)樣緩沖液後溶液變黃，加入1/10體積中和緩沖液将顔色調整為(wèi)藍色後再上(shàng)樣。
1.6 組蛋白(bái)貯存：
組蛋白(bái)溶液-20℃貯存一(yī)周或-80℃長(cháng)期貯存。
二 新鮮組織組蛋白(bái)提取：
2.1即用型裂解緩沖液配制：
常溫融解試劑盒中的試劑，溶解後立即放(fàng)置在冰上(shàng)，混勻。取适當體積的裂解緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的PMSF（100×）和1/40體積去乙酰化酶抑制劑，配成即用型裂解緩沖液，随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。
2.2準備組織：
組織塊迅速置于預冷的1×PBS 中，漂洗數次，濾紙(zhǐ)吸幹水(shuǐ)分，将組織切成細小(xiǎo)的組織塊，稱重組織，按照(zhào)下(xià)表加入各試劑的量
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組織重量（mg）
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即用型裂解緩沖液（μl）
第一(yī)次裂解
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即用型裂解緩沖液（μl）
第二次裂解
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50
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1000
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500
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注：50
mg新鮮組織相(xiàng)當于細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）約為(wèi)100 μl。
2.3 組織裂解：
2.3.1第一(yī)次裂解：組織中加入即用型裂解緩沖液（10倍PCV體積），用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿10-20次,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物(wù)，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。
2.3.2 第二次裂解：4℃ 600 g離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，細胞沉澱中加入即用型裂解緩沖液（5倍PCV體積）。
2.3.3用超聲破碎細胞（推薦130W功率超聲1分鍾，超聲2秒(miǎo)，停頓3秒(miǎo)）或用玻璃勻漿
器(qì)冰浴勻漿5-10次或使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719，蛋白(bái)提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物(wù)，冰浴處理15分鍾。
注：此步驟不要過度勻漿或超聲處理，否則得到(dào)的組蛋白(bái)會(huì)污染較多(duō)的胞漿蛋白(bái)，可以用台盼藍染色觀察細胞裂解情況，建議70-80%細胞裂解為(wèi)适宜裂解程度。加入裂解緩沖液後，細胞膜完全破裂，胞漿完全釋放(fàng)，但細胞核保持完整。鏡檢下(xià)可以看(kàn)到(dào)完全染成藍色的細胞核。
2.3.4 16,000g 4℃離心15分鍾，去掉上(shàng)清，保留沉澱。
2.4 組織組蛋白(bái)提取：
2.4.1 沉澱重懸于0.25 ml 提取緩沖液中，超聲處理（推薦130W功率超聲2分鍾，超聲2秒(miǎo)，停頓3秒(miǎo)），冰浴30分鍾，間歇混勻。
注：超聲處理為(wèi)必須步驟，否則沉澱很難徹底溶解，大大降低(dī)組蛋白(bái)提取得率。
2.4.2 4℃16000g 離心10分鍾，收集組蛋白(bái)上(shàng)清。
2.4.3 即用型中和緩沖液配制：
取适當體積的中和緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的PMSF（100×），1/40體積去乙酰化酶抑制劑和1/500體積
1M DTT，配成即用型中和緩沖液，随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。
2.4.4 組蛋白(bái)上(shàng)清中加入0.3倍體積即用型中和緩沖液，混勻，即為(wèi)組蛋白(bái)提取溶液。
注：組蛋白(bái)溶液電(diàn)泳檢測時，如果加入上(shàng)樣緩沖液後溶液變黃，加入1/10體積中和緩沖液将顔色調整為(wèi)藍色後再上(shàng)樣。
2.5 組蛋白(bái)貯存：
組蛋白(bái)溶液-20℃貯存一(yī)周或-80℃長(cháng)期貯存。
三 實驗示例：
程序：收集2
ml 293細胞（細胞密度1×107），PBS漂洗2次，加入1
ml即用型裂解緩沖液，混勻，冰浴15分鍾；離心收集細胞，加入0.5
ml即用型裂解緩沖液，130W功率超聲1
min，冰浴15分鍾；16000
g離心15分鍾；沉澱中加入0.25
ml即用型提取緩沖液，130W功率超聲2分鍾，冰浴15分鍾；16000
g 離心15分鍾；收集0.2
ml組蛋白(bái)上(shàng)清，加入60
μl中和緩沖液，即為(wèi)組蛋白(bái)提取溶液。取40
μl組蛋白(bái)溶液，加20
μl 5×上(shàng)樣緩沖液，20
μl水(shuǐ)，10
μl中和緩沖液（溶液由黃色變為(wèi)藍色），制備為(wèi)組蛋白(bái)上(shàng)樣溶液，上(shàng)樣5，10，15，20
μl。電(diàn)泳後FastBlue染色30分鍾。