植物(wù)總蛋白(bái)提取試劑盒-通(tōng)用型

Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）

● 産品貨号及規格

● 産品簡介

本産品能(néng)夠有效裂解各種植物(wù)器(qì)官（如葉片，根，莖，果實，種子，花），去除各種植物(wù)樣品（包括富含次生(shēng)代謝物(wù)質和多(duō)糖多(duō)酚的植物(wù)）中常見(jiàn)的污染，如多(duō)糖，多(duō)酚，脂類，色素，次生(shēng)代謝物(wù)等，得到(dào)的高(gāo)純度蛋白(bái)樣品，可以用于SDS-PAGE凝膠電(diàn)泳，Western印迹分析以及雙向電(diàn)泳（2D電(diàn)泳）。

該試劑盒含有除丙酮外的其他所有試劑，使用方便，能(néng)在3小(xiǎo)時内得到(dào)高(gāo)純度的蛋白(bái)樣品。

按照(zhào)每次提取使用0.7ml試劑B計算(suàn)，該試劑盒可以至少使用20次。

●  使用方法：

實驗準備材料：

液氮；研缽；1.5ml離心管；一(yī)次性注射器(qì)；丙酮；80%丙酮；70℃水(shuǐ)浴鍋；幹浴器(qì)；冷凍離心機(jī)；制冰機(jī)；渦旋振蕩器(qì)。

一(yī). 樣品破碎：

1.1 取植物(wù)樣本，在液氮條件(jiàn)下(xià)，用研缽充分研磨成粉末。

關鍵步驟：此步驟非常重要，樣本研磨越細越好，研磨不徹底會(huì)導緻蛋白(bái)濃度偏低(dī)。

二. 沉澱雜(zá)質：

2.1 取1.5 ml離心管，加入1 ml即用型試劑A（按照(zhào)下(xià)表配制），迅速将約0.1克粉末加入其中，漩渦混勻，RT 放(fàng)置5分鍾。

關鍵步驟：樣品粉末量不能(néng)超過0.1克，否則将導緻蛋白(bái)提取得率和純度大大降低(dī)。

即用型試劑A-樣本雜(zá)質去除劑配制

2.212000g4℃離心5分鍾，去除上(shàng)清，保留沉澱。

注：觀察沉澱顔色，如沉澱顔色為(wèi)綠色，繼續步驟2.3；如沉澱顔色為(wèi)淺色或白(bái)色，直接進行步驟2.4。

2.3 沉澱中加入1 ml即用型試劑A，漩渦混勻，RT放(fàng)置5分鍾，12000g4℃離心5分鍾。

2.4 沉澱中加入1 ml 預冷的丙酮（自(zì)備，試劑盒不提供）和10 μl DTT溶液，漩渦震蕩（此時溶液狀态應為(wèi)白(bái)色懸液），徹底重懸，12000g4℃離心5分鍾，去除上(shàng)清，收集沉澱。

2.5 快甩離心數秒(miǎo)，殘留上(shàng)清用移液器(qì)徹底吸棄，沉澱物(wù)通(tōng)風晾幹1-2分鍾至沉澱幹燥。

 關鍵步驟：沉澱不能(néng)過分幹燥，否則會(huì)影響以下(xià)步驟蛋白(bái)的溶解性。

三. 蛋白(bái)粗提：

3.1 蛋白(bái)沉澱中加入0.7 ml 即用型試劑B（按照(zhào)下(xià)表配制），漩渦震蕩，徹底重懸沉澱（此時溶液狀态為(wèi)淡藍色的懸浮溶液）；70℃水(shuǐ)浴1小(xiǎo)時，間歇混勻。

即用型試劑B-植物(wù)蛋白(bái)提取緩沖液配制：

3.212000g4℃離心10分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清（通(tōng)常可取600 μl，溶液為(wèi)淡藍色）于1.5ml離心管中，不要吸取沉澱。

注：此步驟得到(dào)的蛋白(bái)溶液可以進行大多(duō)數蛋白(bái)實驗，如WB。如要進行雙向電(diàn)泳（2D電(diàn)泳）實驗，繼續以下(xià)步驟。

四. 蛋白(bái)純化：

4.1 加入與上(shàng)清等體積的試劑C（注：試劑C上(shàng)層為(wèi)保護相(xiàng)，應該吸取下(xià)部的淡黃色液體），劇烈颠倒震蕩後常溫放(fàng)置1-2分鍾，12000gRT 離心5分鍾，溶液分成兩層，上(shàng)層溶液為(wèi)藍色，蛋白(bái)位于下(xià)層溶液中。

注：試劑C有腐蝕性，請在通(tōng)風櫥内操作，注意防護。

4.2 用一(yī)次性注射器(qì)小(xiǎo)心吸取下(xià)層溶液（通(tōng)常可取350 μl）于1.5 ml離心管中，加入等體積試劑D，劇烈颠倒混勻，12000gRT 離心5分鍾，蛋白(bái)位于上(shàng)層溶液中，收集上(shàng)層溶液（通(tōng)常可取150-200 μl）于1.5ml離心管中。

五. 蛋白(bái)沉澱：

5.1 蛋白(bái)溶液中加入5倍體積溶液E（注意是否已經按照(zhào)标簽所示加入甲醇），颠倒混勻，此時可見(jiàn)有絮狀沉澱生(shēng)産，-20℃ 沉澱30分鍾。

    注：微量蛋白(bái)的提取可以-20℃過夜沉澱。

5.212000g4℃離心10分鍾，收集蛋白(bái)沉澱，去除上(shàng)清。

注：正常的蛋白(bái)沉澱接近無色，如顔色為(wèi)褐色或淡黃色說明蛋白(bái)不純，不能(néng)用于雙向電(diàn)泳實驗。重複步驟3.1-5.2，直至蛋白(bái)沉澱接近無色。

5.3 沉澱中加入1ml 溶液E（注意是否已經按照(zhào)标簽所示加入甲醇），徹底重懸沉澱，12000rpm4℃離心5分鍾，棄上(shàng)清。

5.4 沉澱中加入1ml預冷的80%丙酮（自(zì)備，試劑盒不提供）和10 μl DTT，徹底重懸沉澱，12000g4℃離心5分鍾，棄上(shàng)清。

5.5 快甩離心數秒(miǎo)，殘留上(shàng)清移液器(qì)徹底吸棄，沉澱物(wù)通(tōng)風晾幹1-2分鍾至沉澱幹燥。

   關鍵步驟：沉澱不能(néng)過分幹燥，否則不好溶解。

六. 蛋白(bái)溶解：

6.1 沉澱中溶解于适量PBS溶液或者适當體積樣品緩沖液溶解，-20℃或-80℃貯存。

注：① 如進行雙向電(diàn)泳，樣品溶于雙向電(diàn)泳樣品緩沖液中；如進行單向電(diàn)泳，樣品溶于1×SDS-PAGE 上(shàng)樣緩沖液中。

 ② 由于提取過程中使用了DTT，為(wèi)了避免DTT對蛋白(bái)濃度測定的幹擾，蛋白(bái)定量時盡量選擇Bradford方法。