快速蛋白(bái)高(gāo)靈敏度染色試劑盒

● 貯存、運輸及效期：

常溫保存；常溫運輸；開(kāi)封後一(yī)年(nián)有效。

● 産品簡介

快速蛋白(bái)高(gāo)靈敏度試劑盒是一(yī)種快速簡單、可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白(bái)分離後染色的試劑盒。本試劑盒也可以用于2D凝膠的染色，并且染色後兼容後續的質譜檢測。本試劑盒隻需約90分鍾内可以完成凝膠的染色。對于BSA蛋白(bái)，檢測靈敏度可以達到(dào)0.3 ng蛋白(bái)。

本試劑盒可足夠用于25塊常規的8×10 cm凝膠的染色。

說明書後附有實驗記錄表格，方便記錄實驗步驟。

● 産品組成：

● 注意事(shì)項：

1. 由于該方法染色非常靈敏，操作時請注意盡量使用高(gāo)純度的水(shuǐ)，并确保所使用的器(qì)皿非常清潔，最好使用潔淨的玻璃器(qì)皿。操作時必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。

2. 需自(zì)備乙醇、冰醋酸及MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)。

3. 下(xià)述使用說明中各種溶液的使用量适用于大小(xiǎo)為(wèi)8×10 cm厚度為(wèi)0.75-1 mm的凝膠。對于更大的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放(fàng)大；對于更厚的凝膠，作用時間需按照(zhào)厚度的比例适當延長(cháng)10-20分鍾。

4. 本說明書所指的常溫溫為(wèi)20-25℃，操作溫度較低(dī)時由于溶液的擴散能(néng)力下(xià)降，各步驟需适當延長(cháng)時間。

5. 基本顯色液(10×)在4℃低(dī)溫貯存時可能(néng)會(huì)出現沉澱，可在37℃水(shuǐ)浴中溶解，并充分混勻後使用。

● 使用方法：

一(yī). 固定步驟：

1.1 漂洗：電(diàn)泳結束後，凝膠中加入100 ml雙蒸水(shuǐ)中漂洗5分鍾，重複漂洗1次，去除凝膠表面的電(diàn)泳緩沖液。

1.2 固定：取漂洗後的凝膠放(fàng)入約100 ml固定液中，在搖床上(shàng)常溫搖動20分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。固定40分鍾以上(shàng)甚至過夜可以進一(yī)步降低(dī)背景。

固定液的配制 配制量100 ml

1.3 30%乙醇洗滌：

棄固定液，加入100 ml 30%乙醇，在搖床上(shàng)常溫搖動10分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。

30%乙醇的配制：

70 ml MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)中加入30 ml乙醇，混勻後即成100 ml 30%乙醇。

1.4 水(shuǐ)漂洗：

棄30%乙醇，加入100 ml MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)，在搖床上(shàng)常溫搖動5分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm；重複漂洗一(yī)次。

二. 增敏步驟：

2.1 棄水(shuǐ)，加入100 ml增敏液(1×)，在搖床上(shàng)常溫搖動2分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。

增敏液(1×)的配制：

注：增敏液(1×)配制後需在2小(xiǎo)時内使用。

2.2 水(shuǐ)漂洗(共2次)：

棄原有溶液，加入200 ml MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)，在搖床上(shàng)常溫搖動1分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。 重複此步驟一(yī)次。

三. 染色步驟：

3.1 染色：

棄水(shuǐ)，加入100 ml染色溶液(1×)，在搖床上(shàng)常溫搖動10分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。 染色過程中，凝膠會(huì)呈微微黃色。

染色溶液(1X)的配制：

注：染色溶液(1X)配制後需在2小(xiǎo)時内使用。

3.2 水(shuǐ)洗滌：

棄染色溶液，加入100 ml MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)，在搖床上(shàng)常溫搖動1-1.5分鍾，搖動速度為(wèi)60-70rpm。

注意：水(shuǐ)洗滌的時間不能(néng)超過1.5分鍾。

四. 顯色步驟：

棄水(shuǐ)，加入100 ml顯色液，在搖床上(shàng)常溫搖動3-7分鍾，直至出現比較理想的預期蛋白(bái)條帶，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。

顯色液的配制 配制量100 ml

注：顯色加速液(2000×)有刺激性氣味，建議在通(tōng)風櫥内操作；

顯色液配制後需在20分鍾内使用。

五. 終止步驟：

5.1 漂洗：棄顯色液，加入100 ml雙蒸水(shuǐ)在搖床上(shàng)常溫搖動2分鍾，漂洗掉凝膠上(shàng)殘留的顯色液。

5.2 終止染色：

棄顯色液，加入100 ml終止液(1×)，在搖床上(shàng)常溫搖動10分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。終止時有氣體産生(shēng)屬正常現象，産生(shēng)的氣體為(wèi)二氧化碳。

終止液(1×)的配制：

注：終止液(1×)配制後應當天使用。

5.3 水(shuǐ)洗滌：

棄終止液，加入100 ml MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)，在搖床上(shàng)常溫搖動5分鍾，搖動速度為(wèi)60-70 rpm。

六. 保存：

可在MilliQ級純水(shuǐ)或雙蒸水(shuǐ)中保存或采用适當的方式制備成幹膠。

● 常見(jiàn)問題：

一(yī).  背景太深：

1.1. 步驟四顯色時間過長(cháng)。通(tōng)常顯色反應會(huì)在10分鍾内結束，顯色反應時間過長(cháng)會(huì)導緻背景很深。

1.2. 洗滌不充分。洗滌時間過短，或洗滌液加入的量不足，或者容器(qì)過于狹小(xiǎo)導緻搖動時溶液不易充分混合，或搖動速度過慢(màn)，導緻混勻不充分。請按照(zhào)說明書的建議确保各種溶液的用量和作用時間，搖床的推薦速度為(wèi)60-70 rpm。

1.3 步驟1.2中凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除幹淨。一(yī)方面需确保固定的時間和固定液的用量，另一(yī)方面對于不是最常用的Bis-Tris系統的凝膠需要更長(cháng)的固定時間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低(dī)背景。

1.4 水(shuǐ)的純度太低(dī)。需使用大于16 MΩ·cm的高(gāo)純度水(shuǐ)。

二.  蛋白(bái)條帶非常淺：

2.1 蛋白(bái)的半胱氨酸(Cysteine)殘基的含量特别低(dī)或幾乎沒有。半胱氨酸殘基的存在對于染色非常重要，半胱氨酸殘基的含量過低(dī)會(huì)導緻檢測靈敏度下(xià)降。

2.2 步驟3.2染色後水(shuǐ)洗滌時間過長(cháng)。在染色溶液染色時需嚴格控制水(shuǐ)洗滌的時間，水(shuǐ)洗滌的時間不能(néng)超過1.5分鍾，否則會(huì)導緻過多(duō)的顯色離子被洗去，導緻檢測靈敏度下(xià)降。

2.3 上(shàng)樣量不足。本試劑盒檢測BSA的靈敏度可以達到(dào)0.3 ng，對于不同的蛋白(bái)檢測靈敏度可能(néng)不同。對于一(yī)些蛋白(bái)可能(néng)需要大于1 ng的蛋白(bái)量才能(néng)被檢測到(dào)。

2.4步驟1.3和1.4的洗滌不夠充分。導緻少量乙酸殘留，影響後續檢測。确保30%乙醇洗滌和水(shuǐ)洗滌的用量和時間，可以适當延長(cháng)洗滌時間。

三.  凝膠上(shàng)出現小(xiǎo)點或其它非蛋白(bái)的痕迹：

3.1 凝膠沒有充分被溶液浸沒。請注意選擇大小(xiǎo)合适的容器(qì)，并加入足量的各種溶液，同時需保持适當的混勻速度确保凝膠可以被溶液浸沒。

3.2 用于染色的容器(qì)沒有充分洗滌幹淨。容器(qì)需先用洗滌劑充分洗滌，随後用自(zì)來水(shuǐ)充分沖洗，最後用高(gāo)純度水(shuǐ)再洗滌數次。該容器(qì)最好能(néng)專用于染色，并注意避免各種可能(néng)的蛋白(bái)污染。

3.3 指紋或其它壓痕。請注意戴手套操作，切勿直接接觸皮膚。操作時請注意盡量勿擠壓、

折疊或摩擦凝膠。

3.4 有金屬物(wù)質接觸凝膠。金屬物(wù)質例如金屬鑷子等接觸凝膠會(huì)出現非特異性痕迹。

四.  在60-70 kD處出現一(yī)片模糊的蛋白(bái)染色背景：

皮膚上(shàng)脫落的角蛋白(bái)(keratin)污染了蛋白(bái)樣品。一(yī)方面需注意戴手套操作，另一(yī)方面需注意盛放(fàng)蛋白(bái)樣品的容器(qì)蓋子盡量不要敞開(kāi)，甚至在取放(fàng)蛋白(bái)樣品時在超淨台内進行以避免可能(néng)的角蛋白(bái)污染。

五. 在凝膠的上(shàng)半部分出現黃色背景：

5.1 樣品使用了含有DTT的上(shàng)樣緩沖液。換用含有其它還(hái)原試劑如β-巯基乙醇的上(shàng)樣緩沖液。

5.2 采用Tris-Glycine-SDS電(diàn)泳體系。Tris-Glycine-SDS電(diàn)泳體系中的Glycine會(huì)導緻

背景凝膠的頂端出現輕微的黃色背景。

● 實驗記錄表格

實驗日期：

實驗示例：