4-18%梯度凝膠配制試劑盒

●  貨品内容：

● 産品簡介：

該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電(diàn)泳原理，采用合理設計的預混合配方和配制流程，配合梯度凝膠生(shēng)成系統（貨号：RT-GZY02），可以配制得到(dào)高(gāo)質量的4-18%聚丙烯酰胺梯度凝膠。

本試劑盒大約可以配制常規大小(xiǎo)（8×10cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠厚度決定： 1 mm厚度凝膠可以配制約80-85塊膠。

凝膠緩沖液采用中性pH值，配制好的凝膠4℃可以穩定貯存一(yī)年(nián)。

● 運輸和貯存：

本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。

● 特點：

1. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加有氣味的TEMED；

2. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電(diàn)泳（Native-PAGE）；

3. 穩定性好：凝膠緩沖液為(wèi)中性pH，制備好的凝膠可以4℃穩定貯存一(yī)年(nián)。

● 使用說明：

一(yī)  凝膠制備：

1.1參照(zhào)梯度混合儀設備（貨号：RT-GZY02）說明書，準備儀器(qì)，按照(zhào)圖示将系統連接：

将帶接頭的矽膠管一(yī)端插入到(dào)梯度混合儀側方插口（可以選擇連接藍色閥門(mén)），另一(yī)端與蠕動泵下(xià)方矽膠管接頭連接（蠕動泵溶液方向是一(yī)般為(wèi)下(xià)進上(shàng)出）。藍色閥門(mén)插入到(dào)多(duō)闆制膠器(qì)接口，将不帶接頭矽膠管截取适當長(cháng)度一(yī)端與藍色閥門(mén)連接，另一(yī)端與蠕動泵上(shàng)方矽膠管接頭連接。藍色閥門(mén)旋鈕方向與矽膠管平行為(wèi)開(kāi)啓，旋轉至與矽膠管垂直方向為(wèi)關閉。梯度混合儀左側杆狀旋鈕與地面垂直為(wèi)開(kāi)啓，旋轉與水(shuǐ)平面有夾角為(wèi)關閉。

1.2 蠕動泵使用方法：

按照(zhào)圖示調節蠕動泵。灌裝速度不要太快。

1.3 多(duō)闆制膠器(qì)使用：

使用前将多(duō)闆制膠器(qì)填充塊兩側的保護膜揭掉；

準備好制膠用的厚玻璃闆和短玻璃闆。

将厚玻璃闆和短玻璃闆對齊并在短玻璃闆前方放(fàng)一(yī)張分隔片，此為(wèi)一(yī)套玻闆三明治組合；

将多(duō)闆制膠器(qì)放(fàng)倒，以厚玻闆在下(xià)的方式放(fàng)入玻闆三明治組合，1.0厚度玻璃闆最多(duō)可放(fàng)12套；

插入密封擋闆，在最後一(yī)塊填充塊或者最後一(yī)組玻闆組合前插入适量的分隔片以保證玻闆和填充塊壓緊，然後擰緊螺絲。

在密封擋闆下(xià)面小(xiǎo)孔插入閥門(mén)，并打開(kāi)閥門(mén)（閥門(mén)旋鈕與矽膠管平行為(wèi)開(kāi)啓）。

1.4 配制溶液：

按照(zhào)下(xià)表配制溶液，以制備12闆 4-18% 厚度1.0mm梯度膠為(wèi)例：

梯度混合儀加入溶液前，首先把梯度混合儀閥門(mén)關閉（旋轉旋鈕與水(shuǐ)平面有夾角為(wèi)關閉）。

加入溶液原則：左槽（靠近旋鈕閥門(mén)）加高(gāo)濃度溶液；右槽（靠近出口）加低(dī)濃度溶液。

将磁力攪拌子放(fàng)入右槽中，打開(kāi)磁力攪拌器(qì)（自(zì)備），轉動轉子。

1.5 灌膠操作：

重要步驟：

灌膠前事(shì)先檢查: 梯度混合儀旋鈕是否為(wèi)開(kāi)啓狀态(杆狀旋鈕與水(shuǐ)平面垂直為(wèi)開(kāi)啓):應為(wèi)開(kāi)啓

磁力攪拌子是否轉動：應為(wèi)轉動

蠕動泵是否為(wèi)關閉狀态：應為(wèi)關閉

多(duō)闆制膠器(qì)閥門(mén)是否為(wèi)開(kāi)啓狀态(藍色旋鈕與矽膠管平行為(wèi)開(kāi)啓):應為(wèi)開(kāi)啓

檢查無誤後，打開(kāi)蠕動泵，使用a模式，調節數字為(wèi)25，開(kāi)始灌膠操作。至多(duō)闆制膠器(qì)中的溶液至頂部接近溢出時，首先關閉多(duō)闆制膠器(qì)藍色閥門(mén)（旋鈕與矽膠管垂直為(wèi)關閉）；

暫停蠕動泵；迅速在梯度混合儀左右槽中加滿蒸餾水(shuǐ)，打開(kāi)蠕動泵，徹底沖洗管道。

注：此步驟非常重要，不立即徹底沖洗，殘餘的凝膠會(huì)堵塞梯度混合儀和管道。

仔細插入梳子，盡量一(yī)次成功，避免産生(shēng)氣泡。

37℃ 恒溫箱中凝固2-3小(xiǎo)時。

注：凝固溫度非常關鍵，當室内溫度低(dī)于18度時，凝固時間會(huì)很長(cháng)。

1.6 拆膠：

待凝膠凝固好後，打開(kāi)多(duō)闆制膠器(qì)螺絲，用膠鏟在兩闆之間輕輕撬動，注意不要誤撬玻璃短闆，否則将導緻玻璃闆和膠之間産生(shēng)氣泡，使得凝膠無法使用。用水(shuǐ)将每闆凝膠沖洗幹淨，自(zì)封袋封好，加入2 ml  1×電(diàn)泳緩沖液保持潤濕，4℃水(shuǐ)平放(fàng)置。

二  電(diàn)泳：

2.1 SDS-PAGE變性電(diàn)泳：

2.1.1電(diàn)泳緩沖液配制：

将5×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。

2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上(shàng)樣

5×MonoColor蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上(shàng)樣緩沖液；将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱5-10分鍾；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。

2.1.3 電(diàn)泳過程；

在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。

表三 SDS-PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)

2.2 非變性電(diàn)泳（Native PAGE）：

2.2.1電(diàn)泳緩沖液配制：

将5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。

2.2.2 樣品處理：融化-混合-上(shàng)樣

5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上(shàng)樣緩沖液；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。注：非變性電(diàn)泳樣品不能(néng)加熱處理。

2.2.3 電(diàn)泳過程；

在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液。

表四 Native PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)

三. 染色：

1. 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），條帶1-2分鍾即可見(jiàn)。

2. 搖床常溫搖動10-15分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。

3. 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。

4. 觀察保存結果。