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RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠

RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠

産品編号:RTD6154-0308

産品規格:10闆/盒

數量
價格 ¥500

RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠

産品組成:

貨号

名稱

規格

貯存

RTD6154-0308

RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠

10/

4-8

說明書

一(yī)份

-

産品簡介:

Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電(diàn)泳适合于分離高(gāo)分子量蛋白(bái),可以有效分離50-500 kD範圍内蛋白(bái);電(diàn)泳體系呈中性,抑制半胱氨酸的二次氧化,防止二硫鍵在凝膠中交聯;在變性還(hái)原電(diàn)泳中,電(diàn)泳緩沖體系中加入抗氧化劑,整個(gè)電(diàn)泳過程都在還(hái)原條件(jiàn)下(xià)進行,有效防止二硫鍵的形成。

RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠為(wèi)梯度凝膠,濃度為(wèi)3-8%,厚度為(wèi)1.1 mm,12齒,每個(gè)泳道可以上(shàng)樣最大30 μl樣品。另外,本公司也提供Tris-醋酸-SDS-PAGE電(diàn)泳試劑盒(貨号:RTD6155)包含預制膠、蛋白(bái)上(shàng)樣、蛋白(bái)電(diàn)泳、染色及轉膜所需的全部試劑。

貯存及運輸:

   按照(zhào)标簽溫度貯存;試劑盒常溫運輸。

使用說明:

1. 實驗準備:

1.1 20×樣品還(hái)原劑為(wèi)幹粉,4℃貯存。用前加入1ml超純水(shuǐ)震蕩徹底溶解後使用,已經溶解的20×樣品還(hái)原劑-20℃貯存。

1.2 400×抗氧化劑為(wèi)幹粉,常溫貯存。用前加入15 ml超純水(shuǐ)震蕩徹底溶解後使用,已經溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。

2. 電(diàn)泳:

注:伯樂Mini IIIMini-PROTEAN Tetra Cell,天能(néng)VE-180,六一(yī)24K系列電(diàn)泳槽請确保密封條的安裝方向(如圖)。

六一(yī)其他系列,君意東方JY-SCZ2/4,百晶BG-verMINI等電(diàn)泳槽可以直接使用預制膠。

不兼容Thermol系列電(diàn)泳槽。

2.2 準備1×電(diàn)泳緩沖液:

總體積

1000 ml

10×Tris-醋酸-SDS電(diàn)泳緩沖液

100 ml

超純水(shuǐ)

900 ml

2.2.1 外槽緩沖液:取适量體積1×電(diàn)泳緩沖液用于外槽緩沖液。

2.2.2 内槽緩沖液:對于還(hái)原樣品電(diàn)泳,200 ml 1×電(diàn)泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑,混合均勻後用于内槽緩沖液。對于非還(hái)原樣品電(diàn)泳,直接在内槽中加入1×電(diàn)泳緩沖液,不要添加400×抗氧化劑。

2.3準備上(shàng)樣樣品:

注:表格以配制10 μl樣品為(wèi)例,其他體積按照(zhào)比例調整。

 

總體積10 μl

組份

非還(hái)原樣品

還(hái)原樣品

蛋白(bái)樣品

x μl

x μl

5×MonoClolor蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液 (變性,非還(hái)原)

2 μl

2 μl

20×樣品還(hái)原劑

-

0.5 μl

超純水(shuǐ)

補至10 μl

 

95℃ 10分鍾

2.4電(diàn)泳過程;

在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭沖洗加樣孔3次;随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×電(diàn)泳緩沖液。上(shàng)樣,電(diàn)泳。

恒電(diàn)壓

起始電(diàn)流

結束電(diàn)流

電(diàn)泳時間

150V

40-55 mA/闆膠

25-40 mA/闆膠

60+min

注:冰浴電(diàn)泳(可選)

3. 染色:

3.1 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中,加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液(以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适),搖床常溫搖動,條帶5-10分鍾即可見(jiàn)(蛋白(bái)含量高(gāo)于1 μg條帶)。

3.2 搖床常溫繼續搖動15-30分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。

3.3 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色,期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ),搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。

3.4 觀察保存結果。

4. 轉膜:

4.1 轉印膜選擇:

Tris-醋酸凝膠轉膜可以使用NC膜和PVDF膜,需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。

4.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)配制:

将10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(濕轉,粉末型)粉末溶解于500 ml超純水(shuǐ)中,即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型),不要調節pH,pH~7.2。

4.3 準備1×轉膜緩沖液:

 

 

即用型轉膜緩沖液 配制量 1

 

10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)

100 ml

 

 

變性蛋白(bái)

非變性蛋白(bái)

20 kD蛋白(bái)

無水(shuǐ)甲醇

20%

5-10%

SDS

0.01%

0.01%

20-80 kD蛋白(bái)

無水(shuǐ)甲醇

10%

0-5%

SDS

0.05%

0.05%

80 kD蛋白(bái)

無水(shuǐ)甲醇

10%NC膜)

0-5%PVDF膜)

0%

SDS

0.1%

0.1%

 

超純水(shuǐ)

定容至1升,不要調節pHpH~7.2


注:甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白(bái)更加結合在膜上(shàng),而SDS讓蛋白(bái)更加離開(kāi)膜。因此對大蛋白(bái)轉膜來說,多(duō)加SDS,少加甲醇;而對小(xiǎo)蛋白(bái)轉膜,多(duō)加甲醇,少加SDS。

4.4 轉膜條件(jiàn):

以下(xià)轉膜條件(jiàn)僅供參考,客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái),最好經過1-2次預實驗後,确定最佳的轉膜條件(jiàn)。

膜孔徑

蛋白(bái)大小(xiǎo)

穩流

建議時間

降溫措施

0.22 μm

低(dī)于20 kD

200 mA

~30分鍾

不需要

0.45 μm

20-50 kD

300 mA

~45分鍾

需要

0.45 μm

50-200 kD

350 mA

~50分鍾

需要

0.45 μm

高(gāo)于200 kD

350 mA

~2.5-4.5小(xiǎo)時

需要

 



 
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