蛋白(bái)PAGE凝膠快速制備試劑盒（紅(hóng)色上(shàng)層膠）
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貨号
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說明
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規格
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RTD6133
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蛋白(bái)PAGE凝膠快速制備試劑盒（紅(hóng)色上(shàng)層膠）
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45-90闆膠
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Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit （Red Stacking Gel）
● 貨品内容：
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組份
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貨号
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名稱
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規格
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保存
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1
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AC2914-01
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40%PAA（29：1）
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100 ml
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4℃
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2
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RTD6133-UA
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紅(hóng)色上(shàng)層膠溶液A（2×）
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50 ml
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4℃
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3
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RTD6133-LB
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下(xià)層膠溶液B（2×）
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180 ml
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4℃
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4
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RTD6133-SP
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改良型促凝劑
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8 ml
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4℃，配制後-20℃貯存
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5
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1018210CM
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1.0 mm玻璃闆/梳子套裝
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2套
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RT
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6
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說明書
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-
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● 産品簡介：
該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電(diàn)泳原理，采用合理設計的預混合配方和配制流程，可在30-50分鍾内配制得到(dào)高(gāo)質量的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和非變性蛋白(bái)凝膠電(diàn)泳。本産品可以配制常用下(xià)層膠濃度6%、8%、10%、12%和15%，可以滿足絕大多(duō)數蛋白(bái)電(diàn)泳需求。
本試劑盒可配制45-90塊常規大小(xiǎo)（8×10cm）的PAGE膠，具體凝膠數量和凝膠濃度、厚度以及凝膠的大小(xiǎo)有關。按照(zhào)10%凝膠，大小(xiǎo)8×10cm，可以配置0.75 mm厚度凝膠約90闆，1.0 mm厚度凝膠約68闆，1.5 mm厚度凝膠約45闆。
● 運輸和貯存：
本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。
● 特點：
1. 方便：紅(hóng)色上(shàng)層膠，方便上(shàng)樣；
2. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加TEMED；
3. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電(diàn)泳（Native-PAGE）；
4. 配備1.0 mm厚度玻璃闆和電(diàn)泳梳子，方便實驗。
● 使用說明：
一(yī) 凝膠制備：
1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2 根據下(xià)表參考選擇合适的凝膠濃度：
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下(xià)層膠（下(xià)層膠）濃度
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最佳分離範圍
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3配制一(yī)塊常用凝膠(10×8 cm)所需下(xià)層膠和上(shàng)層膠體積(下(xià)層膠按6厘米高(gāo)度計算(suàn)，上(shàng)層膠按1.5厘米高(gāo)度計算(suàn)，均含約0.2 ml的冗餘量)參見(jiàn)下(xià)表。
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凝膠厚度
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下(xià)層膠體積
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上(shàng)層膠體積
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0.75 mm
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4.0 ml
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1.0 ml
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1.0 mm
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5.0 ml
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1.5 ml
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1.5 mm
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8.0 ml
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2.0 ml
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注：下(xià)層膠體積已包含适量冗餘，請勿全部用于灌制下(xià)層膠，以免灌膠時上(shàng)層膠高(gāo)度不夠。
1.4配制下(xià)層膠：
參考下(xià)表，配制不同濃度的下(xià)層膠。适當混勻後倒入到(dào)制膠模具中，用蒸餾水(shuǐ)或異丙醇或無水(shuǐ)乙醇封住液面，直至下(xià)層膠凝固充分後再進行PAGE上(shàng)層膠的配制。通(tōng)常25℃ 10-40分鍾内下(xià)層膠會(huì)凝固。注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。上(shàng)層膠25℃ 10-15分鍾可以聚合凝固；18℃ 35-40分鍾可以聚合凝固。
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組份
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不同凝膠體積對應各組份的取樣量（ml）
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6％ 膠
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5
ml
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10
ml
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15
ml
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20
ml
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H2O
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1.7
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3.4
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5.1
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6.8
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下(xià)層膠溶液B（2×）
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2.5
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5.0
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7.5
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10.0
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40％ PAA（29:1）
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0.75
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1.5
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2.25
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3.0
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改良型促凝劑
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0.05
|
0.1
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0.15
|
0.2
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8％ 膠
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5 ml
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10 ml
|
15 ml
|
20 ml
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H2O
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1.45
|
2.9
|
4.35
|
5.8
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下(xià)層膠溶液B（2×）
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2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
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40％ PAA（29:1）
|
1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
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改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
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10％ 膠
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5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
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|
H2O
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1.2
|
2.4
|
3.6
|
4.8
|
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下(xià)層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.25
|
2.5
|
3.75
|
5.0
|
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.1
|
0.2
|
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12％ 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
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0.95
|
1.9
|
2.85
|
3.8
|
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下(xià)層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.5
|
3.0
|
4.5
|
6.0
|
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改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
|
15％ 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
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0.575
|
1.15
|
1.725
|
2.3
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下(xià)層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.875
|
3.75
|
5.625
|
7.5
|
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改良型促凝劑
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0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
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1.5配制上(shàng)層膠：
按照(zhào)如下(xià)表格配制4% PAGE上(shàng)層膠。下(xià)層膠灌注後，去除壓膠溶液，配制好的上(shàng)層膠緊貼玻璃闆均勻輕柔注入到(dào)下(xià)層膠上(shàng)，小(xiǎo)心插入梳子等待凝固。
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組份
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不同凝膠體積對應各組份的取樣量（ml）
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4％上(shàng)層膠（上(shàng)層膠）
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2
ml
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4
ml
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6
ml
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8
ml
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H2O
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0.78
|
1.56
|
2.34
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3.12
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紅(hóng)色上(shàng)層膠溶液A（2×）
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1.0
|
2.0
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3.0
|
4.0
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40％ PAA（29:1）
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0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
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改良型促凝劑
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0.02
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0.04
|
0.06
|
0.08
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注：紅(hóng)色上(shàng)層膠緩沖液(2×)使用前須搖勻。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。
上(shàng)層膠25℃ 20-25分鍾可以聚合凝固；18℃ 35-40分鍾可以聚合凝固。
二 電(diàn)泳：
2.1 SDS-PAGE變性電(diàn)泳：
2.1.1電(diàn)泳緩沖液配制：
将5×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上(shàng)樣
5×蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液（變性，還(hái)原）常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl
5×上(shàng)樣緩沖液；将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱5-10分鍾；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。
2.1.3 電(diàn)泳過程；
在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
SDS-PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流（一(yī)闆膠）
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結束電(diàn)流（一(yī)闆膠）
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電(diàn)泳時間
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适用條件(jiàn)
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150V
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35-40
mA
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15-20
mA
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55
+ min
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最佳電(diàn)壓，最優的分辨率
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|
200V
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45-55
mA
|
20-25
mA
|
45+
min
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節省時間
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225V
|
40-50
mA
|
15-20
mA
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35+
min
|
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250V
|
65-75
mA
|
20-25
mA
|
30+
min
|
|
300V
|
70-80
mA
|
25-35mA
|
25+
min
|
最省時間
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2.2 非變性電(diàn)泳（Native PAGE）：
2.2.1電(diàn)泳緩沖液配制：
将5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上(shàng)樣
5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl
5×上(shàng)樣緩沖液；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。注：非變性電(diàn)泳樣品不能(néng)加熱處理。
2.2.3 電(diàn)泳過程；
在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液。
Native PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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适用條件(jiàn)
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推薦電(diàn)壓
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150V
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25-35/闆膠
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5-10 mA/闆膠
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60 + min
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最佳電(diàn)壓，最優的分辨率
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三. 染色：
1. 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），條帶1-2分鍾即可見(jiàn)。
2. 搖床常溫搖動10-15分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。
3. 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。
4. 觀察保存結果。