堿性蛋白(bái)非變性PAGE凝膠制備及電(diàn)泳試劑盒
Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit
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貨号
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名稱
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規格
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RTD6131
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堿性蛋白(bái)非變性PAGE凝膠制備及電(diàn)泳試劑盒
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50次
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● 産品組成：
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序号
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貨号
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名稱
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規格
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保存條件(jiàn)
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1
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AC2913-01
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30%PAA(29:1)
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100 ml
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4℃，避光(guāng)
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2
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RTD6131-02
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4×堿性蛋白(bái)分離膠緩沖液 pH4.3
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100 ml
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4℃
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3
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RTD6131-03
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4×堿性蛋白(bái)濃縮膠緩沖液 pH6.8
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50 ml
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4℃
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4
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RTD6131-04
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100×分離膠促凝劑
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2.5 ml
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-20℃
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5
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AP020P
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APS（幹粉）
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5 ml
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RT
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6
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光(guāng)
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7
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PL110
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5×甲基綠上(shàng)樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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8
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TG160P
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5×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液（幹粉）
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1 L
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RT
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● 産品簡介：
本公司提供的試劑盒包含堿性蛋白(bái)凝膠制備及電(diàn)泳所需的全部試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器(qì)具和蒸餾水(shuǐ)。本試劑盒可用于配制堿性蛋白(bái)非變性(native)PAGE凝膠。本試劑盒可配制30-50塊常規大小(xiǎo)的非變性PAGE膠。
各種蛋白(bái)質分子由于所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數目不同，因而有各自(zì)的等電(diàn)點。凡堿性氨基酸含量較多(duō)的蛋白(bái)質稱為(wèi)堿性蛋白(bái)質，等電(diàn)點偏堿性，如組蛋白(bái)、精蛋白(bái)等。反之，凡酸性氨基酸含量較多(duō)的蛋白(bái)質，等電(diàn)點就(jiù)偏酸性。分離堿性蛋白(bái)時候，要利用低(dī) pH 凝膠系統，分離酸性蛋白(bái)時候，要利用高(gāo) pH 凝膠系統。酸性蛋白(bái)通(tōng)常在非變性凝膠電(diàn)泳中采用的 pH 是 8.8的緩沖系統，蛋白(bái)會(huì)帶負電(diàn)荷，蛋白(bái)會(huì)相(xiàng)陽極移動；而堿性蛋白(bái)通(tōng)常電(diàn)泳是在微酸性環境下(xià)進行，蛋白(bái)帶正電(diàn)荷，這時候需要将陰極和陽極倒置才可以電(diàn)泳。
特别說明：
1. 由于本系統采用非連續凝膠系統，分離膠pH為(wèi)4.3，因此要求待分離的蛋白(bái)等電(diàn)點pI＞7.0，這樣堿性蛋白(bái)在酸性凝膠系統内帶正電(diàn)荷，在凝膠電(diàn)泳中才能(néng)正常向陰極泳動。如果待分離的蛋白(bái)等電(diàn)點pI＜7.0，請選擇非連續Laemmli活性凝膠系統分離（貨号：RTD6130）。
2. 本試劑盒不适用于總蛋白(bái)樣品的電(diàn)泳，也不适用于總蛋白(bái)分離後的Wstern Blot檢測；推薦應用于純化後蛋白(bái)的堿性蛋白(bái)電(diàn)泳。
● 保存及運輸：
按照(zhào)标簽溫度貯存；常溫運輸；開(kāi)封後一(yī)年(nián)有效。
● 使用說明：
一(yī) 配制分離膠
根據目的蛋白(bái)的分子量大小(xiǎo)選擇合适的凝膠濃度（表一(yī)），配制非變性PAGE的分離膠。
表一(yī) 不同濃度的PAGE分離膠的最佳分離範圍
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PAGE分離膠濃度
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最佳分離範圍
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6%
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50-150kD
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8%
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30-90kD
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10%
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20-80kD
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12%
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12-60kD
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15%
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10-40kD
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配制分離膠前，根據以下(xià)配方準備10% APS：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解後分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為(wèi)一(yī)周，-20℃有效期6個(gè)月(yuè)。若發現凝膠聚合時間延長(cháng)，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
制備分離膠步驟：
1．根據下(xià)表，将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡
2．在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-5
cm的水(shuǐ)層，使凝膠表面保持平整。
3．靜(jìng)置15-30分鍾，待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表二 配制不同濃度分離膠所需各組分的體積(毫升)
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組份
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6% 分離膠
5 ml
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8% 分離膠
5 ml
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10% 分離膠
5 ml
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12% 分離膠
5 ml
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15% 分離膠
5 ml
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滅菌水(shuǐ)
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2.7
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2.4
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2
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1.7
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1.2
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4×分離膠緩沖液 pH4.3
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1.25
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1.25
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1.25
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1.25
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1.25
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30％ PAA（29:1）
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1
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1.3
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1.7
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2
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2.5
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100×分離膠促凝劑
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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TEMED
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0.005
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0.005
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0.005
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0.005
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0.005
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10％ APS
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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二 濃縮膠制備：
1．去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層。
2．按照(zhào)表三将不同成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
3．将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端。
4．将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
5．靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表三 堿性蛋白(bái)Native PAGE濃縮膠(5%)配方表
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組份
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5%濃縮膠（2 ml）
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H2O
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1.15
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4×堿性蛋白(bái)濃縮膠緩沖液 pH6.8
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0.5
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30％ PAA（29:1）
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0.33
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TEMED
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0.002
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10％ APS
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0.02
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三 電(diàn)泳：
凝膠凝固好後，根據以下(xià)配方準備電(diàn)泳緩沖液。
5×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液的配制-1 L：将5×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液幹粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，加入冰醋酸11ml，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液（此溶液pH值約為(wèi)4.4）。
将5×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液稀釋5倍即配成1×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液。在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×堿性蛋白(bái)電(diàn)泳緩沖液。上(shàng)樣，把電(diàn)泳電(diàn)源的電(diàn)源線互換，即紅(hóng)色的陽極電(diàn)極查到(dào)陰極孔，黑(hēi)色的陰極電(diàn)極插到(dào)陽極孔，按照(zhào)表四條件(jiàn)，電(diàn)泳，等指示前沿甲基綠電(diàn)泳到(dào)分離膠下(xià)緣後，結束電(diàn)泳，染色或者進行下(xià)一(yī)步實驗。
表四 堿性蛋白(bái)電(diàn)泳條件(jiàn)
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恒電(diàn)壓
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150V
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起始電(diàn)流
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30-40mA/闆膠
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結束電(diàn)流
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10-20mA/闆膠
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電(diàn)泳時間
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40-45分鍾
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實驗示例：
