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2×GC buffer

2×GC buffer

産品編号:RTB3101-01

産品規格:1ml

相(xiàng)關規格:
數量
價格 ¥0

2×GC Buffer

     産品組成:

目錄号

規格

價格

RTB3101-01

1ml





RTB3101-03

10×1ml

300

保存:-20

用途:

PCR 擴增複雜(zá)結構的 DNA 片段。

産品說明和注意事(shì)項:

1. 本産品能(néng)與各種PCR酶配合使用,能(néng)夠擴增具有複雜(zá)二級結構模闆(GC rich、重複序列等)的PCR片段。

2. 使用 GC Buffer 進行 PCR 擴增時,建議使用 Tm 值較高(gāo)的引物(wù)。因此,引物(wù)最好設計在 30 mer 左右。

3. 使用 GC Buffer擴增的 GC rich DNA 片段長(cháng)度,會(huì)因 GC 含量不同而各有差異。

4. 由于 GC Buffer 和一(yī)般的PCR Buffer 相(xiàng)比 DNA 變性效果較強,因此,一(yī)般的 DNA片段(GC含量低(dī)于50%的目的片段)不推薦使用2×GC buffer進行擴增

使用說明:

1. 按照(zhào)下(xià)表在0.2ml PCR管中制備反應體系:

 

成分

25μl反應體系

50μl反應體系

終濃度

Template

0.05-0.5 μg

0.1-1 μg

as you wish

Primer 110 μM

0.5 μl

1 μl

200nM

Primer 210 μM

0.5 μl

1 μl

200nM

2×GC buffer

12.5 μl

25 μl

dNTP Mixture(10 mM)

0.5 μl

1 μl

200μM each

Taq (5 U/μl)

0.25-0.5 μl

0.5-1 μl

2.5-5U

ddH2O

up to 25 μl

up to 50 μl

-

2. 混勻後,離心快甩将反應液收集到(dào)管底。

3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話,補加25μl礦物(wù)油。

4. PCR儀上(shàng)執行以下(xià)程序:

兩步法:

步驟

溫度

時間

循環數

初始變性

94

5 min

1

變性

94

30 sec

25-40*

退火和延伸

68

1 min/kb

最後延伸

72

5 min

1

*注: PCR 反應條件(jiàn)視模闆、引物(wù)等的結構條件(jiàn)不同而各異。在實際操作中需根據模闆、目的片段的大小(xiǎo)、堿基序列和引物(wù)的長(cháng)短等具體情況,設定最佳的反應條件(jiàn)(溫度、時間等)。



1. 怎樣确定擴增片段的GC含量大小(xiǎo)?

   推薦使用Oligo軟件(jiàn)分析片段的GC含量(如下(xià)圖所示)

 

2. 2×GC buffer能(néng)擴增正常GC含量片段嗎(ma)?

2×GC buffer可以擴增GC含量正常的模闆。然而,由于GC buffer有比較強的變性效果,因此一(yī)般的模闆使用GC buffer擴增時,有時會(huì)降低(dī)擴增效率。

3. 2×GC buffer能(néng)兼容大多(duō)數PCR用酶嗎(ma)?

2×GC buffer能(néng)兼容大多(duō)數PCR酶,比如TaqTaq plusLong Taq等,可以根據片段長(cháng)度以及保真性要求選擇不同的酶。

4. 使用GC buffer擴增時,為(wèi)什麽推薦使用兩步法?

由于目的片段GC含量高(gāo),引物(wù)的Tm值往往會(huì)比較高(gāo),在PCR時,當退火溫度和延伸溫度差距較小(xiǎo)時,比如退火溫度超過60時,退火溫度和延伸溫度可以設成同一(yī)數值,一(yī)般為(wèi)68





2×GC buffer
lane 1-5: Rice 390bp fragement(GC% 77.1%)
lane 6-10: Rice 760bp fragement(GC% 72.9%)
lane 1 and 6: TaKaRa 2×GC buffer I
lane 2 and 7: TaKaRa 2×GC buffer II
lane 3 and 8: RTB3101 2×GC buffer
lane 4 and 9: RTB3106 10×Taq PCR buffer
lane 5: Rice 390bp,RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴增
lane 10: Rice 760bp,RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴增




 
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