NP-40裂解液

● 産品包裝：

● 産品簡介：

NP-40裂解液(NP-40  Lysis Buffer)是一(yī)種比較溫和的細胞組織裂解液。NP-40裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品可以最大限度地保持蛋白(bái)的活性狀态（native），可以用于常規的Western、IP和co-IP和ELISA等。NP-40裂解液的主要成分為(wèi) Tris(pH7.4)，NaCl，NP-40等。用NP-40裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品，可以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高(gāo)濃度的去垢劑，不能(néng)用Bradford法測定樣品的蛋白(bái)濃度。

● 保存條件(jiàn)：

-20℃保存，一(yī)年(nián)有效。

● 注意事(shì)項：

1. 為(wèi)取得最佳的使用效果，盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。

2. 需自(zì)備蛋白(bái)酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。

3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。

● 使用說明：

1.  準備即用型裂解緩沖液：

向每1 ml 預冷的裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑（自(zì)備）、蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備），混勻，冰上(shàng)預冷待用。注：即用型緩沖液建議現用現配，30分鍾内使用。

2. 細胞總蛋白(bái)提取：

2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一(yī)遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器(qì)吹打數下(xià)，使裂解液和細胞充分接觸，冰上(shàng)裂解細胞5分鍾，用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上(shàng)繼續裂解15分鍾，間歇混勻。

2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；按照(zhào)細胞沉澱體積（PCM）20 μl加入200 μl 裂解緩沖液的比例加入裂解液，混勻細胞沉澱，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。

注：2×10⁶ Jurkat細胞，其細胞沉澱體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。

2.3 裂解細胞：

裂解混合物(wù)超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據自(zì)有儀器(qì)調整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鍾。

注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取得率和純度。研究蛋白(bái)互作實驗，如Co-IP，考慮到(dào)超聲處理會(huì)影響蛋白(bái)之間的結合，可以不進行超聲處理。

2.4 離心收集上(shàng)清：

充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取：

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的PBS或生(shēng)理鹽水(shuǐ)中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙(zhǐ)吸幹組織表面液體，将組織切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入即用型裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物(wù)，超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據自(zì)有儀器(qì)調整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719，蛋白(bái)提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。

注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取得率和純度。

3.4 充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

4. 注意事(shì)項

4.1 所有的試劑及器(qì)具均需預冷後使用,以保持蛋白(bái)質的完整性和活性。

4.2 産品中的保存條件(jiàn)及有效期均以未開(kāi)封情況下(xià)計算(suàn)，為(wèi)了防止産品與空氣接觸發生(shēng)化學反應影響産品性能(néng)，将未使用完畢的組分按存儲要求保存同時建議開(kāi)封後的組分盡快使用完畢。

4.3 裂解細胞步驟使用超聲處理或針頭處理極其關鍵，否則蛋白(bái)得率會(huì)很低(dī)。

4.4 一(yī)般常規提取的蛋白(bái)樣品，進行後續試驗不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白(bái)或後續試驗結果不理想，則需要将提取的蛋白(bái)樣品進行透析脫鹽。

4.5 提取的蛋白(bái)質可以采用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（目錄号：RTP7102），由于裂解緩沖液中含有較高(gāo)濃度的去垢劑，不能(néng)用Bradford法測定樣品的蛋白(bái)濃度。

4.6 如果用于蛋白(bái)質質譜研究，可采用快速蛋白(bái)銅染試劑盒（貨号：RTD6207）或快速蛋白(bái)鋅染試劑盒（貨号：RTD6206）或快速蛋白(bái)銀(yín)染試劑盒（貨号：RTD6401）對膠上(shàng)的蛋白(bái)質進行染色，這些染色方法對蛋白(bái)質沒有修飾作用，所以對質譜圖沒有影響。對于一(yī)般的染色，可以采用FastBlue蛋白(bái)染色液（貨号：RTD6202）來染色。

實驗示例：