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RIPA裂解液(弱)

RIPA裂解液(弱)

産品編号:RL1040

産品規格:100ml

數量
價格 ¥200

RIPA裂解液()

産品包裝:

産品編号

産品名稱

産品包裝

說明書

RL0140

RIPA裂解液()

100 ml

1

産品簡介:

RIPA裂解液(RIPA  Lysis  Buffer)是一(yī)種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio  Immunoprecipitation  Assay。RIPA裂解液的配方有很多(duō)種,根據其裂解液的強度大緻可以分為(wèi)強、中、弱三類。RIPA裂解液(弱)的主要成分為(wèi)Tris  (pH7.4),NaCl,1%  NP-40,0.25% sodium deoxycholate,以及sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多(duō)種抑制劑,可以有效抑制蛋白(bái)降解。用RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品,可以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高(gāo)濃度的去垢劑,不能(néng)用Bradford法測定由本裂解液裂解得到(dào)樣品的蛋白(bái)濃度。

保存條件(jiàn):

-20℃保存,一(yī)年(nián)有效。

注意事(shì)項:

1.為(wèi)取得最佳的使用效果,盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。

2. RIPA裂解液的裂解産物(wù)中經常會(huì)出現一(yī)小(xiǎo)團透明膠狀物(wù),屬正常現象。該透明膠狀物(wù)為(wèi)含有基因組DNA等的複合物(wù)。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下(xià),可以直接離心取上(shàng)清用于後續實驗;如果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái),則可以通(tōng)過超聲處理打碎打散該透明膠狀物(wù),随後離心取上(shàng)清用于後續實驗。如果檢測一(yī)些常見(jiàn)的轉錄因子,例如NF-kappaB、p53等時,通(tōng)常不必進行超聲處理,就(jiù)可以檢測到(dào)這些轉錄因子。

使用說明:

1.  準備RIPA裂解液:

融解RIPA裂解液,混勻;取适當量的裂解液,在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。

2. 細胞蛋白(bái)提取:

2.1 貼壁細胞:去除培養液,加入适量1×PBS,輕柔漂洗一(yī)遍,不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器(qì)吹打數下(xià),使裂解液和細胞充分接觸,冰上(shàng)裂解細胞5分鍾,用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中,冰上(shàng)繼續裂解15分鍾,間歇混勻。

培養闆規格/培養皿表面積

細胞量

RIPA推薦使用量

100 mm培養皿

1.5×107

0.5-1 ml

60 mm培養皿

5×106

0.25-0.5 ml

35 mm培養皿

2×106

0.2-0.4 ml

6孔闆

2.5×106

100-200 μl

24孔闆

5×105

100-150 μl

96孔闆

1×105

50-100 μl

2.2 懸浮細胞:450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;用适量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重複漂洗細胞一(yī)次;按照(zhào)細胞沉澱體積(PCV)20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA,混勻細胞沉澱,冰浴處理15分鍾,間歇混勻。

注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉澱體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為(wèi)20 μl。

2.3 裂解細胞:

裂解混合物(wù)超聲波處理(超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整,建議條件(jiàn)為(wèi));如沒有超聲破碎儀,可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次(貨号:PE2719 ,蛋白(bái)提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鍾。

注:裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進行超聲或針頭裂解處理,會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠,大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。

2.4 離心收集上(shàng)清:

充分裂解後,4℃ 16000 g離心10分鍾,取上(shàng)清,即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取:

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中,漂洗數次,洗淨組織血迹,用濾紙(zhǐ)吸

幹組織表面液體,将組織切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液,如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品,可以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次,收集勻漿後的裂解混合物(wù),超聲波處理(超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整,建議條件(jiàn)為(wèi));如沒有超聲破碎儀,可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次(貨号:PE2719 ,蛋白(bái)提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。

注:裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進行超聲或針頭裂解處理,會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠,大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。

3.4 充分裂解後,4℃ 16000 g離心10分鍾,取上(shàng)清,即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3.    實驗示例:



 
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