RIPA裂解液(中)
● 産品包裝：
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産品編号
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産品名稱
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産品包裝
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說明書
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RL0130
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RIPA裂解液(中)
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100 ml
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1份
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● 産品簡介：
RIPA裂解液(RIPA Lysis
Buffer)是一(yī)種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多(duō)種，根據其裂解液的強度大緻可以分為(wèi)強、中、弱三類。RIPA裂解液(中)的主要成分為(wèi)Tris
(pH 7.4)， NaCl， 1% NP-40， 0.5%
sodium deoxycholate， 0.1%
SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多(duō)種抑制劑，可以有效抑制蛋白(bái)降解。用RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品，可以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高(gāo)濃度的去垢劑，不能(néng)用Bradford法測定由本裂解液裂解得到(dào)樣品的蛋白(bái)濃度。
● 保存條件(jiàn)：
-20℃保存，一(yī)年(nián)有效。
● 注意事(shì)項：
1.為(wèi)取得最佳的使用效果，盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。
2. RIPA裂解液的裂解産物(wù)中經常會(huì)出現一(yī)小(xiǎo)團透明膠狀物(wù)，屬正常現象。該透明膠狀物(wù)為(wèi)含有基因組DNA等的複合物(wù)。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下(xià)，可以直接離心取上(shàng)清用于後續實驗；如果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái)，則可以通(tōng)過超聲處理打碎打散該透明膠狀物(wù)，随後離心取上(shàng)清用于後續實驗。如果檢測一(yī)些常見(jiàn)的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通(tōng)常不必進行超聲處理，就(jiù)可以檢測到(dào)這些轉錄因子。
● 使用說明：
1. 準備RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。
2. 細胞蛋白(bái)提取：
2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一(yī)遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器(qì)吹打數下(xià)，使裂解液和細胞充分接觸，冰上(shàng)裂解細胞5分鍾，用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上(shàng)繼續裂解15分鍾，間歇混勻。
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培養闆規格/培養皿表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔闆
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔闆
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5×105
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100-150 μl
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96孔闆
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；按照(zhào)細胞沉澱體積（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細胞沉澱，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。
2.3 裂解細胞：
裂解混合物(wù)超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。
2.4 離心收集上(shàng)清：
充分裂解後，4℃ 16000
g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。
3. 組織樣品蛋白(bái)提取：
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙(zhǐ)吸
幹組織表面液體，将組織切成細小(xiǎo)的碎片。
3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物(wù)，超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。
3.4 充分裂解後，4℃ 16000
g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。
實驗示例：
Jurkat RIPA總蛋白(bái)提取，GAPDH檢測
總蛋白(bái)提取：4×106 Jurkat細胞，450 g 離心收集，去上(shàng)清，PBS漂洗兩次，沉澱中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上(shàng)裂解5分鍾，4℃ 16000 g 15 分鍾，上(shàng)清即為(wèi)總蛋白(bái)（TP）。
電(diàn)泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉膜：NC膜，1×RealBlot快速轉膜液濕轉，穩流400 mA，電(diàn)壓變化64-57 V，轉膜時間35 min
封閉：無蛋白(bái)快速封閉液，RT 20 min
一(yī)抗孵育：GAPDH 羊抗兔多(duō)抗，一(yī)抗稀釋液稀釋1：2000
二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀釋液稀釋1：5000
檢測：ECL發光(guāng)檢測
