RIPA裂解液(強)
● 産品包裝：
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産品編号
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産品名稱
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産品包裝
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說明書
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RL1020
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RIPA裂解液(強)
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100 ml
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1份
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● 産品簡介：
RIPA裂解液(RIPA
Lysis Buffer)是一(yī)種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多(duō)種，根據其裂解液的強度大緻可以分為(wèi)強、中、弱三類。RIPA裂解液(強)的主要成分為(wèi)50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton
X-100，1%
sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium
fluoride，EDTA，EGTA等多(duō)種抑制劑。可以有效抑制蛋白(bái)降解。由于含有較高(gāo)濃度的Triton X-100等幹擾物(wù)質，不能(néng)用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得到(dào)樣品的蛋白(bái)濃度，可以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨号：RTP7104）測定蛋白(bái)濃度。
● 保存條件(jiàn)：
-20℃保存，一(yī)年(nián)有效。
● 注意事(shì)項：
1.為(wèi)取得最佳的使用效果，盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。
2. RIPA裂解液的裂解産物(wù)中經常會(huì)出現一(yī)小(xiǎo)團透明膠狀物(wù)，屬正常現象。該透明膠狀物(wù)為(wèi)含有基因組DNA等的複合物(wù)。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下(xià)，可以直接離心取上(shàng)清用于後續實驗；如果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái)，則可以通(tōng)過超聲處理打碎打散該透明膠狀物(wù)，随後離心取上(shàng)清用于後續實驗。如果檢測一(yī)些常見(jiàn)的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通(tōng)常不必進行超聲處理，就(jiù)可以檢測到(dào)這些轉錄因子。
● 使用說明：
1. 準備RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。
2. 細胞蛋白(bái)提取：
2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一(yī)遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器(qì)吹打數下(xià)，使裂解液和細胞充分接觸，冰上(shàng)裂解細胞5分鍾，用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上(shàng)繼續裂解15分鍾，間歇混勻。
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培養闆規格/培養皿表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔闆
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔闆
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5×105
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100-150 μl
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96孔闆
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；按照(zhào)細胞沉澱體積（PCM）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細胞沉澱，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉澱體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。
2.3 裂解細胞：
裂解混合物(wù)超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。
2.4 離心收集上(shàng)清：
充分裂解後，4℃ 16000
g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。
3. 組織樣品蛋白(bái)提取：
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙(zhǐ)吸
幹組織表面液體，将組織切成細小(xiǎo)的碎片。
3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物(wù)，超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。
3.4 充分裂解後，4℃ 16000
g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。
實驗示例：
Jurkat RIPA總蛋白(bái)提取，GAPDH檢測
總蛋白(bái)提取：4×106 Jurkat細胞，450 g 離心收集，去上(shàng)清，PBS漂洗兩次，沉澱中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上(shàng)裂解5分鍾，4℃ 16000 g 15 分鍾，上(shàng)清即為(wèi)總蛋白(bái)（TP）。
電(diàn)泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉膜：NC膜，1×RealBlot快速轉膜液濕轉，穩流400 mA，電(diàn)壓變化64-57 V，轉膜時間35 min
封閉：無蛋白(bái)快速封閉液，RT 20 min
一(yī)抗孵育：GAPDH 羊抗兔多(duō)抗，一(yī)抗稀釋液稀釋1：2000
二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀釋液稀釋1：5000
檢測：ECL發光(guāng)檢測
實驗示例：
1、作用：①利用去污劑破壞脂質雙分子層，破裂細胞；②溶解蛋白(bái)；③蛋白(bái)變性使其穩定；④抑制蛋白(bái)酶/核酸酶活性（根據後續實驗的目的不同，裂解液中會(huì)加入蛋白(bái)酶抑制劑或DNA/RNA酶抑制劑，方便目的物(wù)的提取。）2、細胞裂解液有效成分一(yī)般使用的是去污劑。去污劑是由一(yī)個(gè)疏水(shuǐ)尾端基團和一(yī)個(gè)極性親水(shuǐ)頭端基團組成的有機(jī)化合物(wù)。在一(yī)定的溫度條件(jiàn)下(xià)，以特定濃度溶解于水(shuǐ)時，去污劑分子會(huì)形成膠束，疏水(shuǐ)基團部分位于膠束内部，而極性親水(shuǐ)基團則在其外部。去污劑膠束的疏水(shuǐ)核心區域與蛋白(bái)質的疏水(shuǐ)表面結合，形成可溶性的蛋白(bái)質-去垢劑複合物(wù)。去污劑根據其親水(shuǐ)基團的不同分為(wèi)：陰/陽離子去污劑、非離子型兩性去污劑、兩性去污劑。1）陰/陽離子型去污劑：離子去污劑是由一(yī)個(gè)疏水(shuǐ)鏈和一(yī)個(gè)陽離子或陰離子的極性頭端基團組成。此類去污劑活性較強，作用強烈，會(huì)更大程度的改變蛋白(bái)質的結構，更容易受到(dào)pH、離子強度和反離子的性質等因素影響。如陰離子去污劑-十二烷基硫酸鈉（SDS）、陰離子去污劑-脫氧膽酸鈉（Sodium deoxycholate）等。
離子型去污劑：非離子型去污劑和離子型不同，它們的頭端基團是沒有極性的親水(shuǐ)基團，是比較溫和的表面活性劑。它們可以破壞蛋白(bái)質-脂質以及脂質-脂質之間的連接，但是不能(néng)破壞蛋白(bái)質-蛋白(bái)質的連接，而且大多(duō)非離子去污劑不能(néng)使蛋白(bái)質變性。因此，這種去污劑可以使蛋白(bái)質溶解和分離，但卻保留了蛋白(bái)質的天然構象、功能(néng)以及它們的相(xiàng)互作用。如Triton X-100、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、Tween-80等。
3）兩性去污劑：兩性離子去污劑頭端基團是親水(shuǐ)性，含有正負電(diàn)荷各一(yī)個(gè)，因此呈現電(diàn)中性。兩性去污劑在酸性溶液中是正離子，在堿性溶液是負離子， 可在任何酸堿度的溶液中使用。相(xiàng)對于離子型去污劑其更少産生(shēng)變性，相(xiàng)對于非離子型去污劑，又(yòu)可以更有效的破壞蛋白(bái)質-蛋白(bái)質鍵并減少聚集。如CHAPS。3、裂解液的配置通(tōng)常使用的是Tris緩沖液。Tris，三羟甲基氨基甲烷，是一(yī)種有機(jī)化合物(wù)，溶于乙醇和水(shuǐ)，是核酸和蛋白(bái)質的溶劑，廣泛應用于生(shēng)物(wù)化學和分子生(shēng)物(wù)學實驗中緩沖液的制備。
Tris為(wèi)弱堿，在25°C下(xià)，它的pKa為(wèi)8.1；根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖範圍在pH7.0到(dào)9.2之間。0.1mol/l的水(shuǐ)溶液pH為(wèi)10.4，一(yī)般加入鹽酸以調節pH值，即可獲得所需pH值的緩沖液。
主要應用有：①1M Tris-HCl pH6.8、1.5M Tris-HCl pH8.8和5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液是SDS-PAGE最常用的試劑。②在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液被用于DNA的穩定和儲存。将調節pH值的鹽酸換為(wèi)乙酸即可以得到(dào)“TAE（Tris/Acetate/EDTA）緩沖液”，換成硼酸則獲得“TBE（Tris/Borate/EDTA）緩沖液”。TAE和TBE緩沖液常用于核酸電(diàn)泳實驗中。
不同裂解成分的裂解強度不同，可以根據不同的實驗需求選用不同的裂解液。
1、NP40 lysis buffer：主要成分為(wèi)50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40。NP-40是一(yī)種很溫和的非離子型去污劑，1%濃度基本可以破壞掉細胞膜，而對核膜的破壞作用較弱，結合特定的緩沖液可以獲得胞漿蛋白(bái)，适用于膜蛋白(bái)非變性條件(jiàn)下(xià)的溶解。與蛋白(bái)結合力強，用于防止物(wù)質分子疏水(shuǐ)間相(xiàng)互作用，确保蛋白(bái)的充分溶解和結構穩定。常用于常規的Western、IP和co-IP和ELISA，如需要裂解細胞核膜獲取核蛋白(bái)，可用1%NP40+0.1%SDS（WB實驗）或用1%NP40+超聲（IP實驗）。2、SDS lysis buffer：主要成分為(wèi)50mM Tris (pH8.1)，1% SDS；是一(yī)種比較強烈的細胞組織裂解液，可裂解核膜；用于常規Western、ChIP等。3、RIPA裂解液：組分為(wèi)25 mM Tris-HCl, pH 7.6、150 mM NaCl、1% NP-40、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）。RIPA裂解液是一(yī)種傳統的細胞組織快速裂解液，獲得的蛋白(bái)樣品可用于常規WB、IP等實驗。
4、IP裂解液：組分為(wèi)25 mM Tris-HCl, pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、1% mM EDTA、5% 甘油。IP裂解液是一(yī)種改良後的RIPA裂解液，具中等強度效力，可高(gāo)效溶解細胞蛋白(bái)，但不會(huì)像RIPA一(yī)樣釋放(fàng)染色體組DNA或破壞蛋白(bái)複合物(wù)。适合下(xià)遊免疫沉澱或親和吸附應用。
5、Tris-Triton裂解液：組分為(wèi)10mM Tris，pH7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA（鈣離子螯合劑）、1% Triton X-100、10% 甘油、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉。Tris-Triton裂解液是非離子型表面活性劑，效力介于NP-40和SDS之間，下(xià)遊應用有WB、ELISA、IP。
6、紅(hóng)細胞裂解液：
紅(hóng)細胞裂解液是一(yī)種比較溫和的紅(hóng)細胞去除方法，它既不損傷有核細胞又(yòu)能(néng)充分的去除紅(hóng)細胞；主要用于經酶消化分散的組織細胞的分離純化，淋巴細胞的分離純化以及組織細胞蛋白(bái)與核酸提取等實驗中紅(hóng)細胞的去除。經紅(hóng)細胞裂解液裂解得到(dào)的組織細胞中不含紅(hóng)細胞，可進一(yī)步用于原代培養、細胞融合、流式細胞分析、核酸與蛋白(bái)的分離和提取等。
氯化铵是紅(hóng)細胞裂解液的主要效應物(wù)質，氨根離子不能(néng)通(tōng)過細胞膜，而其他離子可以通(tōng)過，造成細胞内外的離子濃度差異，形成了滲透壓差，外部的水(shuǐ)分會(huì)擴散至細胞内，使紅(hóng)細胞膨脹，達到(dào)裂解的效果。由于紅(hóng)細胞結構相(xiàng)對簡單，因此膨脹的耐受能(néng)力較差，絕大部分就(jiù)會(huì)被漲破。碳酸鹽的主要作用為(wèi)PH緩沖。EDTA與鎂離子和鈣離子形成的螯合物(wù)主要起到(dào)破壞細胞膜穩态的作用，此作用對白(bái)細胞影響很小(xiǎo)，所以這種裂解液可以在裂解紅(hóng)細胞的同時較小(xiǎo)的影響白(bái)細胞。
RIPA 貨号：RL1020
使用該産品發表部分文章列表：
1. [2022 IF=2.1] METTL3-mediated methylation of CYP2C19
mRNA may aggravate clopidogrel resistance in ischemic stroke patients.
Author: Quandan Tan, Le Yang, Shanshan Yuan, Danni
Zheng, Yapeng Lin, Kejie Chen, Ying He, Shuntian Chen, Junli Hao, Jin Dai, Song
He, Fengkai Mao, Xinyi Leng, Haisong Jiang, Jie Yang.
Journal: Open Medicine 2024; 19: 20240899.
Institution： University of Electronic Science and
Technology of China
Paper link：https://doi.org/10.1515/med-2024-0899