SDS-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液(1×)

SDS-PAGE Protein Loading Buffer（1×）

● 産品簡介：

SDS-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液(SDS-PAGE Protein Loading Buffer, 1×)，是一(yī)種經過改良的以溴酚藍為(wèi)染料的蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液。可以直接用于細胞或組織樣品的裂解，并用于後續常規的SDS-PAGE蛋白(bái)樣品的上(shàng)樣。使用該産品直接裂解蛋白(bái)樣品的優點是比較便捷；缺點是裂解好的蛋白(bái)樣品不能(néng)用常規的蛋白(bái)定量方法測定蛋白(bái)濃度。這樣蛋白(bái)上(shàng)樣量的均一(yī)性就(jiù)較難控制，需要借助考馬斯亮藍等的染色結果或Western的檢測結果，來調整上(shàng)樣量。當細胞量或組織用量能(néng)控制得比較均一(yī)時，使用本裂解液直接裂解獲取蛋白(bái)樣品會(huì)比較便捷。

本緩沖液已經含有還(hái)原劑DTT，有輕微刺激性氣味。

● 保存條件(jiàn)：

-20℃保存，開(kāi)封後有效期1年(nián)。

●  使用方法：

1. 在常溫或不超過37℃的水(shuǐ)浴中溶解SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液(1×)。水(shuǐ)浴溶解後立即常溫存放(fàng)，盡量避免長(cháng)時間置于水(shuǐ)浴中。

2. 細胞樣品：

2.1 對于貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生(shēng)理鹽水(shuǐ)或無血清培養液洗一(yī)遍。按照(zhào)6 孔闆每孔（細胞數量~2.5×10⁶）加入150-250微升SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液(1×)的比例加入裂解液。用槍吹打數下(xià)，使SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液(1×)和細胞充分接觸。通(tōng)常SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液(1×)接觸細胞1-2秒(miǎo)後，細胞就(jiù)會(huì)被裂解。裂解後的樣品收集到(dào)1.5 ml離心管内。

2.2 對于懸浮細胞：450 g 4℃離心5分鍾收集細胞，棄上(shàng)清，用手指把細胞用力彈散。按照(zhào)6孔闆（細胞數量~2.5×10⁶）每孔細胞加入150-250微升SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液(1×)，再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解後應沒有明顯的細胞沉澱。

3.組織樣品：

3.1 把組織剪切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20毫克組織加入150-250微升SDS-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液(1×)的比例加入緩沖液。

注：如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的上(shàng)樣緩沖液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少上(shàng)樣緩沖液的用量。

3.3 用玻璃勻漿器(qì)勻漿或者用27#針頭抽打5-10次，直至充分裂解。

3.4 充分裂解後，将樣品收集到(dào)1.5 ml離心管内。

注：如果組織樣品本身非常細小(xiǎo)，可以适當剪切後直接加入裂解液裂解，通(tōng)過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。直接裂解的優點是比較方便，缺點是不如使用勻漿器(qì)那樣裂解得比較充分。

4. 95-100℃加熱10分鍾，以充分變性蛋白(bái)。

注：加熱前通(tōng)常會(huì)發現蛋白(bái)樣品内有粘稠的半透明狀物(wù)體，通(tōng)常在上(shàng)樣緩沖液内加熱8-10分鍾後該粘稠的半透明狀物(wù)體消失。如果起始時細胞或組織的用量較大，基因組DNA含量較高(gāo)，加熱10分鍾後有可能(néng)仍然比較粘稠或者有粘稠狀的半透明物(wù)體。此時需要再煮沸10分鍾或者補加适量1×的蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液後再煮沸5分鍾。充分煮沸後一(yī)方面可以使結合在基因組DNA上(shàng)的蛋白(bái)充分釋放(fàng)，同時會(huì)導緻基因組DNA的部分斷裂從(cóng)而使粘稠感消失，這樣就(jiù)不會(huì)影響後續的上(shàng)樣操作了。

5. 樣品冷卻到(dào)常溫後，12000 rpm離心2分鍾，上(shàng)清即可直接上(shàng)樣到(dào)SDS-PAGE凝膠加樣孔内。通(tōng)常電(diàn)泳至藍色染料到(dào)達膠的底端處附近即可停止電(diàn)泳。