Percoll不連續密度梯度沉澱法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞

(一(yī)) 原理

Percoll是一(yī)種包有乙烯吡咯烷酮的矽膠顆粒。滲透壓很低(dī)(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小(xiǎo)，可形成高(gāo)達1.3g／ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低(dī)離心力(200～1000g)于數分至數十分鍾内達到(dào)滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低(dī)，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生(shēng)物(wù)膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還(hái)可将受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

二)操作方法及注意事(shì)項
1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到(dào)生(shēng)理性滲透壓，然後用生(shēng)理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀釋到(dào)所需濃度。
Percoll濃度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml   1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

2.不連續密度梯度Percoll層的制備: 先将試管壁用牛血清濕潤，除去多(duō)餘血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下(xià)，使形成滿意的界面。在制備過程中一(yī)般用長(cháng)針頭注射器(qì)從(cóng)高(gāo)密度向低(dī)密度逐層放(fàng)置，有時相(xiàng)鄰兩層Percoll比重相(xiàng)差不大時，可将Percoll液放(fàng)入注射器(qì)中，小(xiǎo)針頭斜面緊貼管壁，任其自(zì)然慢(màn)慢(màn)流下(xià)。
    3.裝樣：樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異，一(yī)般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高(gāo)，否則會(huì)影響細胞的分離和回收。
    4.離心：一(yī)般采用離心力為(wèi)400g，時間20～25min。由于多(duō)層Percoll之間密度差别不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢(màn)，要平穩。
    5.取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液後收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌後可供培養或檢測用。
(三)分離純化細胞舉例
1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下(xià)向上(shàng)逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從(cóng)外周血中分離的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一(yī)般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上(shàng)下(xià)二層的Percoll液中。
    2.純化淋巴母細胞和除去死細胞：分别疊加50％和30％Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高(gāo)比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為(wèi)小(xiǎo)淋巴細胞；兩層Percoll之間為(wèi)淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上(shàng)，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能(néng)的研究。

(四) 人不同血細胞的漂浮密度
表   人不同血細胞的漂浮密度
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細 胞   漂浮密度    │ 細 胞       漂浮密度
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紅(hóng)細胞 1.09-1.11 │淋巴細胞 1.052-1.077
粒細胞  │ B淋巴細胞 1.062-1.075
嗜酸性 1.09-1.095  │ T淋巴細胞 1.065-1.077
嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母細胞 1.065-1.077
單核細胞 1.050-1.066 │自(zì)然殺傷細胞 1.050-1.070
血小(xiǎo)闆 1.030-1.060 │
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