Hochest 33342即用型染色液
Hochest 33342 Stain
RTU Solution,10 μg/ml
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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貯存
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HE1013S
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Hochest
33342即用型染色液
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10
ml
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-20℃
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
Hoechst 33342，也稱bisBenzimide
H 33342 或HOE 33342，分子式為(wèi)C27H28N6O·3HCl
，分子量MW561.93，CAS:
23491-52-3，是一(yī)種可以穿透細胞膜的藍色熒光(guāng)染料，對細胞的毒性較低(dī)。Hoechst
33342 專一(yī)性地與雙鏈DNA結合（優先結合AT），常用于細胞核染色。染色後可以用熒光(guāng)顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342 的最大激發波長(cháng)為(wèi)346 nm（紫外激發），最大發射波長(cháng)為(wèi)460nm（藍色熒光(guāng)）；Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結合後，最大激發波長(cháng)為(wèi)350nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)461nm。另外，由于Hoechst 33342專一(yī)性結合DNA，不與RNA結合，樣品無需使用RNase處理。與DAPI相(xiàng)比，Hoechst
33342具有更好的膜通(tōng)透性，更适合于活細胞的染色。
Hoechst 33342和Hoechst
33258相(xiàng)比，Hoechst 33342對細胞的毒性作用更小(xiǎo)一(yī)些，33258穿透能(néng)力較33342弱，染活細胞時容易被"泵出"，也就(jiù)是拒染。所以一(yī)般來說Hoechst 33258用于細胞固定後再染色，而Hoechst33342則可以對活細胞直接進行染色。
本染色液為(wèi)即用型，濃度為(wèi)10
μg/ml，可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色，也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色。
● 貯存：
-20℃避光(guāng)保存，一(yī)年(nián)有效。
● 操作步驟：
一(yī).固定後的細胞樣品染色：
1.1 貼壁細胞：
1.1.1 取潔淨蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鍾或更長(cháng)時間，無菌超淨台内吹幹或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一(yī)遍。将蓋玻片置于六孔闆内，種入細胞培養過夜，生(shēng)長(cháng)至50%-80%滿度。
1.1.2刺激細胞發生(shēng)凋亡後，吸盡培養液，加入0.5
ml固定液，固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。
1.1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。
1.1.4加入0.5
ml Hoechst 33342染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分鍾，手動晃動數次。
1.1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。
1.1.6滴一(yī)滴抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng)，蓋上(shàng)貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。
1.1.7 熒光(guāng)顯微鏡使用紫外激發，可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350nm左右，發射波長(cháng)460nm左右。
注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議染色後盡快檢測。
1.2懸浮細胞：
1.2.1 500 g（2400
rpm，下(xià)同）離心收集凋亡處理後細胞樣品于1.5 ml離心管内，加入0.5
ml固定液，緩緩懸起細胞，常溫固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。
1.2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，洗滌期間手動晃動數次。
1.2.3 細胞沉澱中加入0.5
ml Hoechst 33342染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分鍾，手動晃動數次。
1.2.4 離心收集沉澱，重懸于100 μl PBS中。
1.2.5 取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng)，加入等體積步驟1.2.4染色後細胞重懸液，蓋上(shàng)一(yī)潔淨的蓋玻片，盡量避免氣泡。
1.2.6 熒光(guāng)顯微鏡下(xià)紫外激發，可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350 nm左右，發射波長(cháng)460 nm左右。
注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議染色後盡快檢測。
二.活細胞染色：
2.1 加入适當量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通(tōng)常對于六孔闆一(yī)個(gè)孔需加入1 ml染色液，對于96孔闆一(yī)個(gè)孔需加入100微升染色液。
2.2 在适宜于細胞培養的溫度下(xià)培養20-30分鍾。棄染色液，用PBS洗滌2-3次即可進行熒光(guāng)檢測。細胞發生(shēng)凋亡時，在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察會(huì)看(kàn)到(dào)凋亡細胞的細胞核呈緻密濃染，或呈碎塊狀緻密濃染。
三. 實驗示例:
HeLa細胞染色圖。圖A為(wèi)正常細胞Hoehst
33342的染色效果圖。圖B中除了正常細胞外，還(hái)清晰可見(jiàn)呈現緻密濃染的凋亡細胞。
操作流程： Jurkat細胞，計數1×106/ml；500 g 3 min收集2 ml 細胞；細胞沉澱中加入1 ml卡諾固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉澱中加入200 μl Hoechst 33342即用型染色液（10 μg/ml）；37度避光(guāng)染色10 min； 離心後細胞沉澱重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上(shàng)，加5 μl 抗熒光(guāng)淬滅劑，封片觀察。