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Hochest 33342即用型染色液

Hochest 33342即用型染色液

産品編号:HE1013S

産品規格:10ml

數量
價格 ¥150


Hochest 33342即用型染色液

Hochest 33342 Stain RTU Solution,10 μg/ml

●  産品組成:

貨号

名稱

規格

貯存

HE1013S

Hochest 33342即用型染色液

10 ml

-20

 

說明書

一(yī)份

 

● 産品簡介:

Hoechst 33342,也稱bisBenzimide H 33342 或HOE 33342,分子式為(wèi)C27H28N6O·3HCl ,分子量MW561.93,CAS: 23491-52-3,是一(yī)種可以穿透細胞膜的藍色熒光(guāng)染料,對細胞的毒性較低(dī)。Hoechst 33342 專一(yī)性地與雙鏈DNA結合(優先結合AT),常用于細胞核染色。染色後可以用熒光(guāng)顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342 的最大激發波長(cháng)為(wèi)346 nm(紫外激發),最大發射波長(cháng)為(wèi)460nm(藍色熒光(guāng));Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結合後,最大激發波長(cháng)為(wèi)350nm,最大發射波長(cháng)為(wèi)461nm。另外,由于Hoechst 33342專一(yī)性結合DNA,不與RNA結合,樣品無需使用RNase處理。與DAPI相(xiàng)比,Hoechst 33342具有更好的膜通(tōng)透性,更适合于活細胞的染色。

Hoechst 33342和Hoechst 33258相(xiàng)比,Hoechst 33342對細胞的毒性作用更小(xiǎo)一(yī)些,33258穿透能(néng)力較33342弱,染活細胞時容易被"泵出",也就(jiù)是拒染。所以一(yī)般來說Hoechst 33258用于細胞固定後再染色,而Hoechst33342則可以對活細胞直接進行染色。

本染色液為(wèi)即用型,濃度為(wèi)10 μg/ml,可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色,也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色。

貯存:

-20℃避光(guāng)保存,一(yī)年(nián)有效。

● 操作步驟:

一(yī).固定後的細胞樣品染色:

1.1 貼壁細胞:

1.1.1 取潔淨蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鍾或更長(cháng)時間,無菌超淨台内吹幹或用無菌的PBS洗滌三遍,再用細胞培養液洗滌一(yī)遍。将蓋玻片置于六孔闆内,種入細胞培養過夜,生(shēng)長(cháng)至50%-80%滿度。

1.1.2刺激細胞發生(shēng)凋亡後,吸盡培養液,加入0.5 ml固定液,固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。

1.1.3去盡固定液,用PBS洗兩遍,每次3分鍾,吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33342染色液,37℃避光(guāng)染色10-15分鍾,手動晃動數次。

1.1.5去盡染色液,用PBS洗兩遍,每次3分鍾,吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.1.6滴一(yī)滴抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng),蓋上(shàng)貼有細胞的蓋玻片,讓細胞接觸封片液,盡量避免氣泡。

1.1.7 熒光(guāng)顯微鏡使用紫外激發,可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350nm左右,發射波長(cháng)460nm左右。

注:熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題,建議染色後盡快檢測。

1.2懸浮細胞:

1.2.1 500 g(2400 rpm,下(xià)同)離心收集凋亡處理後細胞樣品于1.5 ml離心管内,加入0.5 ml固定液,緩緩懸起細胞,常溫固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。

1.2.2離心去盡固定液,用PBS洗兩遍,每次3分鍾,洗滌期間手動晃動數次。

1.2.3 細胞沉澱中加入0.5 ml Hoechst 33342染色液,37℃避光(guāng)染色10-15分鍾,手動晃動數次。

1.2.4 離心收集沉澱,重懸于100 μl PBS中。

1.2.5 取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng),加入等體積步驟1.2.4染色後細胞重懸液,蓋上(shàng)一(yī)潔淨的蓋玻片,盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光(guāng)顯微鏡下(xià)紫外激發,可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350 nm左右,發射波長(cháng)460 nm左右。

注:熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題,建議染色後盡快檢測。

.活細胞染色:

2.1 加入适當量Hoechst 33342染色液,必須充分覆蓋住待染色的樣品,通(tōng)常對于六孔闆一(yī)個(gè)孔需加入1 ml染色液,對于96孔闆一(yī)個(gè)孔需加入100微升染色液。

2.2 在适宜于細胞培養的溫度下(xià)培養20-30分鍾。棄染色液,用PBS洗滌2-3次即可進行熒光(guāng)檢測。細胞發生(shēng)凋亡時,在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察會(huì)看(kàn)到(dào)凋亡細胞的細胞核呈緻密濃染,或呈碎塊狀緻密濃染。

. 實驗示例:



HeLa細胞染色圖。圖A為(wèi)正常細胞Hoehst 33342的染色效果圖。圖B中除了正常細胞外,還(hái)清晰可見(jiàn)呈現緻密濃染的凋亡細胞。


操作流程: Jurkat細胞,計數1×106/ml;500 g 3 min收集2 ml 細胞;細胞沉澱中加入1 ml卡諾固定液,常溫固定10 min;1×PBS漂洗兩次;細胞沉澱中加入200 μl Hoechst 33342即用型染色液(10 μg/ml);37度避光(guāng)染色10 min; 離心後細胞沉澱重懸于100 μl 1×PBS中;取5 μl細胞懸液滴于載玻片上(shàng),加5 μl 抗熒光(guāng)淬滅劑,封片觀察。


 
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