AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒

AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

● 産品組成：

●  産品簡介：

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）隻分布在細胞膜脂質雙層的内側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜内側翻向外側。Annexin V 是一(yī)種分子量為(wèi)35～36kD 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白(bái)，與磷脂酰絲氨酸有高(gāo)度親和力，故可通(tōng)過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為(wèi)檢測細胞早期凋亡的靈敏指标之一(yī)。将Annexin V 進行熒光(guāng)素FITC 标記，以标記了的Annexin V 作為(wèi)熒光(guāng)探針，利用熒光(guāng)顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生(shēng)。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一(yī)種核酸染料，它不能(néng)透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能(néng)夠透過細胞膜而使細胞核染紅(hóng)。因此将Annexin V 與PI 匹配使用，就(jiù)可以将處于不同凋亡時期的細胞區分開(kāi)來。

以每次使用5 μl Annexin V-FITC計算(suàn)，本試劑盒FP2050M可以檢測50個(gè)樣品。

●  包裝組份：

●  保存條件(jiàn)：

4oC保存，一(yī)年(nián)有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光(guāng)保存。

● 操作步驟：

一(yī). 懸浮細胞操作流程：

1.1 誘導凋亡的操作步驟 (以Jurkat細胞為(wèi)例)：

1.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Jurkat細胞懸液。

1.1.2 加入終濃度為(wèi)1 μM 的凋亡誘導劑 (STS，Staurosuporine，星孢菌素)。

1.1.3 在37℃培養箱培養3 h。

注：1 μM Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。最佳誘導條件(jiàn)請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。

1.2 Annexin V染色操作步驟：

1.2.1 将細胞懸液轉移到(dào)離心管中，500 g（2500 rpm）離心3 min，去除上(shàng)清液。

1.2.3沉澱中加入PBS，500 g（2500 rpm）離心 3 min，去除上(shàng)清液。重複漂洗一(yī)次。

1.2.4加入Annexin V-FITC結合液，制成終濃度為(wèi)1×10⁶ 個(gè)/ml的細胞懸液。

注：加入結合液的體積根據實驗目的自(zì)行調整，一(yī)般推薦不少于500 μl。

1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制備的細胞懸液，加入到(dào)一(yī)個(gè)新的離心管中。

1.2.6 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

1.2.7 常溫下(xià)避光(guāng)放(fàng)置15 min，即為(wèi)待檢液。

1.3 結果檢測：

1.3.1 流式細胞儀檢測：

步驟1.2.7中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結合液。激發波長(cháng)Ex = 488 nm；發射波長(cháng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光(guāng)通(tōng)過FITC通(tōng)道 (FL1) 檢測；PI的紅(hóng)色熒光(guāng)通(tōng)過PI 通(tōng)道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議1小(xiǎo)時内完成檢測。

1.3.2 熒光(guāng)顯微鏡檢測：

取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻片上(shàng)，加5μl 抗熒光(guāng)淬滅封片液，封片觀察。

注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議染色後盡快檢測。

二. 懸浮細胞操作流程：

2.1 誘導凋亡的操作步驟 (以Caco-2細胞為(wèi)例)：

2.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Caco-2細胞懸液，将細胞懸液接種到(dào)培養皿或者培養闆中。

2.1.2 在37℃ 5% CO₂培養箱中預培養。

2.1.3加入終濃度為(wèi)25 μM的凋亡誘導劑 (Cisplatin，順鉑)。

2.1.4 在37℃5% CO₂培養箱中培養4 days。

2.2  Annexin V染色操作步驟：

2.2.1吸出細胞培養液至離心管中待用，細胞用PBS洗滌，加入适量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。

2.2.2 常溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下(xià)來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

2.2.3加入步驟2.2.1中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到(dào)離心管内，2000 rpm 5 min，小(xiǎo)心吸除上(shàng)清。

注意：加入的細胞培養液一(yī)方面可以收集已經懸浮的發生(shēng)凋亡或壞死的細胞，另一(yī)方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解後續加入的Annexin V-FITC導緻染色失敗。

2.2.4 細胞沉澱中加入預冷PBS輕輕重懸細胞，2000 rpm 5 min，小(xiǎo)心吸除上(shàng)清；重複洗滌一(yī)次。

2.2.5細胞沉澱中加入适量Annexin V-FITC結合液，制成終濃度為(wèi)1×10⁶ 個(gè)/ml的細胞懸液。

注：加入結合液的體積根據實驗目的自(zì)行調整，一(yī)般推薦不少于500 μl。

2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的細胞懸液，加入到(dào)一(yī)個(gè)新的離心管中。

2.2.7 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

2.2.8 常溫下(xià)避光(guāng)放(fàng)置15 min，即為(wèi)待檢液。

2.3 結果檢測：

2.3.1 流式細胞儀檢測：

步驟2.2.8中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結合液。激發波長(cháng)Ex = 488 nm；發射波長(cháng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光(guāng)通(tōng)過FITC通(tōng)道 (FL1) 檢測；PI的紅(hóng)色熒光(guāng)通(tōng)過PI 通(tōng)道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議1小(xiǎo)時内完成檢測。

2.3.2 熒光(guāng)顯微鏡檢測：

取步驟2.2.8的待檢液5 μl滴于載玻片上(shàng)，加5μl 抗熒光(guāng)淬滅封片液，封片觀察。

檢測程序：

Jurkat細胞調整到(dào)1×10⁶/ml，6孔闆接種2 ml；凋亡處理加10 μl 0.2 M STS（星型飽菌素），終濃度為(wèi)1 μM；37度 5%二氧化碳培養3小(xiǎo)時；2 ml收集，PBS漂洗2次，重懸于300 μl 結合液中；調整細胞密度為(wèi)1×10⁶/ml制成細胞懸液。取100 μl細胞懸液加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液，RT 避光(guāng)靜(jìng)置15min，取5 μl加5 μl封片液，封片觀察。FITC（+）PI（+）為(wèi)凋亡晚期細胞（40×）。

● 注意事(shì)項：

1. 本試劑盒适用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低(dī)于1×10⁶，不推薦用于檢測組織樣本。

2. 推薦使用懸浮培養細胞。如果是貼壁細胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不當，可能(néng)引起假陽性，而用細胞刮子會(huì)造成細胞粘連成團，而影響檢測。

3. 細胞固定後可能(néng)導緻熒光(guāng)的淬滅，請不要固定樣品。

4. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-FITC，最終導緻染色失敗。

5 .因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器(qì)不同，因而流式檢測的熒光(guāng)補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為(wèi)對照(zhào)，進行熒光(guāng)補償的調節。