細胞膜紅(hóng)色熒光(guāng)染色試劑盒（DiI）

● 産品介紹：

細胞膜紅(hóng)色熒光(guāng)染色試劑盒(DiI)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一(yī)種以DiI為(wèi)熒光(guāng)探針，能(néng)夠快速靈敏地對細胞膜進行紅(hóng)色熒光(guāng)染色标記的試劑盒。

DiI在進入細胞膜之前熒光(guāng)非常弱，僅當進入到(dào)細胞膜後才可以被激發出很強的熒光(guāng)。DiI被激發後可以發出橙紅(hóng)色的熒光(guāng)，DiI和磷酯雙層膜結合後的激發光(guāng)譜和發射光(guāng)譜參考上(shàng)圖。其中，最大激發波長(cháng)為(wèi)549nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)565nm。

本試劑盒如果用于流式細胞儀，每個(gè)樣品的檢測體系體積為(wèi)0.5 ml時，可以進行200次檢測；96孔闆每孔檢測體系的體積為(wèi)100 μl時可以進行1000次檢測。

● 産品組成：

● 貯存：

DiI（400×） -20℃避光(guāng)保存，一(yī)年(nián)有效。染色緩沖液可以4℃貯存。

● 使用說明：

1. 細胞膜染色工(gōng)作液制備：

細胞膜染色工(gōng)作液的用量：對于6、12、24、96孔闆，每孔的細胞膜染色工(gōng)作液分别為(wèi)1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個(gè)樣品的細胞膜染色工(gōng)作液為(wèi)0.5ml；對于切片，可以根據切片大小(xiǎo)，每個(gè)切片使用100-200μl的細胞膜染色工(gōng)作液。

注：不同細胞的最佳染色濃度略有不同，細胞膜染色工(gōng)作液的最終濃度建議根據不同細胞系和實驗體系進行優化，可在1:100-1:400之間進行調整。

2. 懸浮活細胞染色：

2.1 加入适當體積的細胞膜染色工(gōng)作液重懸細胞，使其密度為(wèi)1×10⁶/ml左右。

2.2 37℃避光(guāng)孵育細胞5-20 min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以5 min作為(wèi)初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到(dào)最佳的熒光(guāng)染色效果。

2.3 500×g常溫離心5 min。

2.4 吸除上(shàng)清液，緩慢(màn)加入37℃預熱的細胞培養液重懸細胞。

2.5 用細胞培養重複漂洗沉澱一(yī)次。

2.6 流式細胞儀檢測，或将細胞封片觀察，封片時請避免使用含有甘油或其它有機(jī)物(wù)的封片劑，否則會(huì)影響染色并增加熒光(guāng)背景，可以直接用PBS封片，在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察。

3. 貼壁活細胞染色：

3.1 将貼壁細胞種于細胞培養皿、多(duō)孔細胞培養闆或者細胞爬片上(shàng)。

3.2 吸除細胞培養液，用PBS洗滌細胞2次。

3.3 加入适當體積的細胞膜染色工(gōng)作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

3.4 37℃避光(guāng)孵育細胞5-20 min，不同的細胞最佳培養時間不同。以5min作為(wèi)初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到(dào)最佳的熒光(guāng)染色效果。

3.5 吸除細胞膜染色工(gōng)作液，用PBS洗滌2次，然後加入37℃預熱的細胞培養液即可在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察。

4. 固定後細胞或切片的染色：

注：DiI不建議用于固定後細胞或組織的染色，因為(wèi)細胞固定後影響了細胞膜的結構，不能(néng)準确反映熒光(guāng)标記位置。以下(xià)步驟僅供參考：

4.1. 使用4%多(duō)聚甲醛固定液進行固定。

4.2 吸除固定液，用PBS洗滌細胞3遍。

4.3 使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100進行通(tōng)透，常溫10 min。然後用PBS洗滌細胞3遍。

4.4按照(zhào)免疫染色的方法進行抗體的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能(néng)含有去垢劑。

4.5加入适當體積的細胞膜染色工(gōng)作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞或樣品。

4.6 37℃避光(guāng)孵育5-20 min，最佳染色時間需要根據自(zì)己的實驗條件(jiàn)摸索，以達到(dào)最佳的熒光(guāng)染色效果。

4.7吸除細胞膜染色工(gōng)作液，用PBS洗滌2-3次，随後即可在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察。

● 實驗示例：

操作程序：293細胞調整密度1×10⁵/ml，接種到(dào)6孔闆中，培養30小(xiǎo)時；去除培養基，PBS漂洗一(yī)次；33342染色37度10分鍾，去除33342染色液，加1.5 ml PBS，觀察拍照(zhào)（40×）（圖A）；去除PBS，DiI染色，37度10分鍾，去除DiI染色液，加1.5ml PBS，觀察拍照(zhào)（40×）（圖B）