10×BN轉膜緩沖液

● 簡介：

10×BN轉膜緩沖液（10×Blue Native Transfer Buffer）适用于BN蛋白(bái)電(diàn)泳後凝膠上(shàng)非變性蛋白(bái)的轉膜。本轉膜液配制便捷，稀釋後無需調節pH值，pH約為(wèi)7.5-7.7。該緩沖液最終可配成10升即用型1×緩沖液（根據需求補加甲醇）。

● 保存和運輸：

粉末裝常溫保存，常溫運輸，兩年(nián)有效；配成10×轉膜緩沖液後4℃貯存，一(yī)年(nián)有效；加入甲醇的即用型轉膜緩沖液4℃貯存，一(yī)個(gè)月(yuè)有效。

● 配制方法：

将10×轉膜緩沖液粉末全部溶解于1升超純水(shuǐ)中，徹底溶解，即配成10×轉膜緩沖液。

根據下(xià)表配制成1×即用型轉膜緩沖液

注：轉膜緩沖液中加入甲醇對蛋白(bái)有固定作用，轉膜分子量較大的蛋白(bái)少加或不加甲醇，轉膜分子量較小(xiǎo)的蛋白(bái)要加至多(duō)20%的甲醇。非變性蛋白(bái)的轉膜可以不加甲醇。

● 使用方法：

1. BN電(diàn)泳介紹：

Blue Native PAGE（BN-PAGE）是一(yī)種從(cóng)生(shēng)物(wù)樣品（質膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 範圍的蛋白(bái)質複合物(wù)的電(diàn)泳技(jì)術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)将蛋白(bái)複合體從(cóng)細胞膜中以近似天然的狀态分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白(bái)結合而使其帶負電(diàn)荷，根據蛋白(bái)分子量不同在 PAGE膠中得到(dào)分離。BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白(bái)都覆蓋上(shàng)負電(diàn)荷，可以分離堿性蛋白(bái)（pI＞7）。BN電(diàn)泳可以選擇Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒(U型闆3-12%預制膠，通(tōng)用型)（貨号：RTD6139-0312或RTD6139-0416）

2. 電(diàn)泳後凝膠預處理（可選步驟）：

凝膠浸泡于适量1×即用型BN轉膜緩沖液（加終濃度0.1% SDS）中，搖床慢(màn)搖10分鍾。

注：凝膠浸泡在含SDS緩沖液中，能(néng)讓蛋白(bái)帶上(shàng)更多(duō)的負電(diàn)荷，有利于蛋白(bái)的轉膜。

3. 轉膜：

3.1轉膜方法：BN電(diàn)泳後的轉膜建議用濕轉法。

3.2膜的選擇：BN電(diàn)泳轉膜必須使用PVDF膜，不能(néng)用NC膜（NC膜會(huì)與考馬斯亮藍G-250不可逆結合，很難清除幹淨）。根據蛋白(bái)大小(xiǎo)選擇膜的孔徑。一(yī)般說來，大于20 kD蛋白(bái)選擇0.45 μm孔徑，低(dī)于20 kD選擇0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前要用無水(shuǐ)甲醇潤濕活化。

3.3 三明治結構：轉膜三明治結構與傳統轉膜相(xiàng)同，即根據“黑(hēi)膠白(bái)膜”制作三明治，即膜置于轉膜夾芯正極一(yī)側，凝膠置于轉膜夾芯負極一(yī)側，這樣凝膠上(shàng)帶負電(diàn)荷的蛋白(bái)才能(néng)轉移到(dào)膜上(shàng)。

蛋白(bái)轉膜三明治制作：

負極（電(diàn)轉夾黑(hēi)色面）-海綿墊-1層1 mm厚度濾紙(zhǐ)-凝膠-膜-1層1 mm厚度濾紙(zhǐ)-海綿墊-正

極（電(diàn)轉夾白(bái)色面）

3.4 轉膜條件(jiàn)：

由于在非變性條件(jiàn)下(xià)，不同蛋白(bái)的空間結構，聚合狀态，電(diàn)荷數量都有不同，以下(xià)轉膜條件(jiàn)僅供參考，客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái)，最好經過1-2次預實驗後，确定最佳的轉膜條件(jiàn)。

4. 洗膜：

PVDF膜用無水(shuǐ)甲醇清洗10分鍾，徹底去除藍色G250。

5. 進行後續WB操作：封閉-一(yī)抗-二抗-檢測。