細胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒

●  産品組成：

● 産品簡介：

Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式為(wèi)C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分子量為(wèi)533.88，CAS Number 23491-45-4。該染料是一(yī)種可以穿透細胞膜的藍色熒光(guāng)染料，對細胞的毒性較低(dī)，常用于細胞凋亡檢測，染色後可用熒光(guāng)顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33258也用于普通(tōng)的細胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258的最大激發波長(cháng)為(wèi)346nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)460nm，與雙鏈DNA結合後，最大激發波長(cháng)為(wèi)352nm， 最大發射波長(cháng)為(wèi)461nm。

Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)為(wèi)您提供了一(yī)種經典而又(yòu)快速簡便的細胞凋亡檢測方法。細胞發生(shēng)凋亡時，染色質會(huì)固縮。所以Hoechst 33258染色後，在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會(huì)呈緻密濃染，或呈碎塊狀緻密濃染，顔色有些發白(bái)。

按照(zhào)每次使用0.5 ml染色液計算(suàn)，該試劑盒可以使用100次。

● 貯存：

4℃避光(guāng)保存，一(yī)年(nián)有效。

● 操作步驟：

一(yī). 鐵壁細胞：

1.1 取潔淨蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鍾或更長(cháng)時間，無菌超淨台内吹幹或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一(yī)遍。将蓋玻片置于六孔闆内，種入細胞培養過夜，生(shēng)長(cháng)至50%-80%滿度。

1.2刺激細胞發生(shēng)凋亡後，吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。

1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分鍾，手動晃動數次。

1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.6滴一(yī)滴抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng)，蓋上(shàng)貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

1.7 熒光(guāng)顯微鏡使用紫外激發，可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350nm左右，發射波長(cháng)460nm左右。

注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議染色後盡快檢測。

二.懸浮細胞：

2.1 500 g（2400 rpm，下(xià)同）離心收集凋亡處理後細胞樣品于1.5 ml離心管内，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細胞，常溫固定10分鍾或更長(cháng)時間(可4℃過夜)。

2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鍾，洗滌期間手動晃動數次。

2.3 細胞沉澱中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分鍾，手動晃動數次。

2.4 離心收集沉澱，重懸于100 μl PBS中。

2.5 取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上(shàng)，加入等體積步驟2.4染色後細胞重懸液，蓋上(shàng)一(yī)潔淨的蓋玻片，盡量避免氣泡。

2.6 熒光(guāng)顯微鏡下(xià)紫外激發，可檢測到(dào)呈藍色的細胞核。激發波長(cháng)350 nm左右，發射波長(cháng)460 nm左右。

注：熒光(guāng)染料都存在淬滅的問題，建議染色後盡快檢測。

三 實驗示例

操作流程：使用不同濃度星飽菌素（Staurosporine，STS）凋亡處理Jurkat細胞。調整細胞密度為(wèi)1×10⁶/ml，每孔2 ml接種于六孔闆中；加入終濃度為(wèi)0，0.1，0.5，1，2，4 μM STS，37℃ 5%CO₂培養3小(xiǎo)時；500 g 3 min收集細胞；細胞沉澱中加入1 ml固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉澱中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10 min；離心後細胞沉澱重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上(shàng)，加5 μl 抗熒光(guāng)淬滅劑，封片觀察。